專家點評Nature Genetics | 張毅團隊證明體內DUX並非小鼠胚胎基因組激活的關鍵因子
點評 | 汪陽明（北京大學）
責編 | 兮
高度分化的精子和卵子在受精之後如何轉變成具有全能性（totipotency）的受精卵一直是發育生物學中尚待解決的問題。在受精之後較短的時間裡，受精卵的生命活動主要依賴於卵子發育過程中積累的母源因子。隨著母源因子的逐漸消耗和降解，受精卵的繼續發育需要其自身基因組的激活來提供必需的相關物質。這一過程也稱之為胚胎基因組激活（zygotic genome activation，ZGA）。因為胚胎基因組激活是受精卵獲得全能性的必要條件之一，所以對於ZGA機制的研究一直是幹細胞生物學，表觀遺傳學，和發育生物學等領域的熱門課題。然而，哪些母源因子負責激活胚胎基因組和受精過程怎樣調控母源因子去激活胚胎基因組目前尚不清楚。研究ZGA的技術瓶頸主要在於哺乳動物早期胚胎中只有極少量的細胞。而實驗材料來源的限制導致很多的常見的生物學方法難以應用到涉及早期胚胎的研究中。近年來，一些能夠用少量細胞來檢測全基因組染色質修飾技術的建立使得人們對ZGA這一生命現象有了更深入的理解。例如，通過對胚胎基因組激活時期開放染色質區域轉錄因子結合特徵序列的分析，張毅教授和劉江教授課題組發現了轉錄因子Nfya和OCT4分別在激活小鼠和人的胚胎基因組中起重要作用【1,2】。由於Nfya和OCT4隻能激活一小部分胚胎基因組，這說明負責激活胚胎基因組的主要轉錄因子還未找到。
在小鼠的胚胎幹細胞中，有少量的細胞（～1%）能夠表達一些在胚胎基因組激活時期特異性表達的基因，例如MERVL和Zscan4。因為小鼠的胚胎基因組激活發生在2-細胞胚胎時期，所以這些細胞也被稱之為2-cell embryo-like embryonic stem cells （2C-likecells）。2C-like 細胞和2-細胞胚胎的轉錄組具有一定的相似性，並且與2-細胞胚胎相比，2C-like 細胞更容易獲取。目前，2C-like 細胞是最為常見的用於研究胚胎基因組激活的體外實驗模型。
2017 年，通過研究2C-like 細胞，三個課題組分別報導了DUX/DUX4轉錄蛋白可能是激活小鼠和人胚胎基因組的關鍵因子【3-5】。DUX/DUX4是屬於Homeobox家族的轉錄激活因子。DUX/DUX4在基因組上位於一段約160kb串聯重複的序列中。每一個重複序列單元中都包含一個DUX/DUX4的開放閱讀框。目前並沒有DUX/DUX4敲除小鼠的報導，所以DUX/DUX4在正常發育過程中的功能尚不清楚。但是，DUX/DUX4在肌肉細胞中的異常激活會導致面肩胛肱型肌營養不良症（Facioscapulohumeral muscular dystrophy， FSHD）。這三篇研究論文主要發現肌肉細胞或胚胎幹細胞中過表達DUX/DUX4會激活一部分只有在胚胎基因組激活時期才會表達的基因。過表達DUX/DUX4不但能夠把2C-like 細胞在胚胎幹細胞中的比例從1%提高到50-70%，而且敲除或敲降DUX/DUX4之後，胚胎幹細胞失去了轉變成2C-like 細胞的能力。這一系列的實驗研究證明DUX/DUX4是在2C-like 細胞中激活ZGA基因的必要因子。然而DUX/DUX4在2-細胞胚胎中對基因組激活的功能還未被證明。
2019年5月27日，來自哈佛醫學院的張毅教授、陳志遠博士研究團隊在Nature Genetics雜誌上在線發表了題為Loss of DUX causes minor defects in zygotic genome activation and is compatible with mouse development 的文章。該團隊發現，與2C-like細胞中的關鍵作用相反，DUX並非是小鼠2-細胞時期激活胚胎基因組的必要轉錄因子。
利用CRIPSR-Cas9技術，研究人員在小鼠中成功敲除了約160kb基因組片段，其中包括每個DUX拷貝的串聯重複序列。與預期相反，DUX純合敲除胚胎並沒有表現出胚胎基因組激活失敗的2-細胞發育阻滯表型。這些胚胎著牀後的發育也基本正常，純合小鼠出生的比例在雜合子相互交配的後代中只比預期少了約25%。由於這些純合敲除小鼠父母本都是雜合子，而其中一個DUX拷貝Gm4981是母源因子（Gm4981與其它拷貝相比在5『端缺失其中一個DNA結合域），這些小鼠胚胎能夠存活有可能是由於母源的Gm4981補償效應。為了驗證這一假設，研究人員接下來測試了DUX純合敲除小鼠的繁殖能力。即使沒有母源Gm4981和其它DUX拷貝，胚胎也沒有表現出2-細胞發育阻滯，而是能夠發育到成年。但是DUX純合敲除小鼠相互交配發育到成年小鼠約是對照的一半，說明DUX缺失對胚胎髮育有一定的影響。這一發現與最近Didier Trono課題組發表在bioRxiv上的結果相似。
為了確認DUX在胚胎基因組激活中的非必要性，研究人員分析了DUX/Gm4981 缺失的小鼠1-細胞和2-細胞胚胎的轉錄組。1-細胞時期的轉錄組在DUX/Gm4981敲除胚胎和對照之間幾乎沒有差別。而在2-細胞時期，與對照相比，DUX/Gm4981敲除胚胎有少量的基因和重複序列表達水平下調。通過分析2906個在2-細胞時期激活的胚胎組基因，只有小部分（17%）在DUX/Gm4981敲除胚胎中下調超過2倍。值得注意的是，除了一小部分基因外（12.5%），絕大部分之前報導的外源DUX在2C-like細胞中的目標基因在DUX/Gm4981敲除的2-細胞胚胎中都表達正常。這一系列結果說明，DUX在小鼠胚胎基因組激活中並不起關鍵作用，並且它在小鼠胚胎髮育過程中也不是必要的。
總之，本文通過分析DUX敲除小鼠證明瞭 DUX對於胚胎基因組激活並不是必要的。此結論與以前發表的DUX在2C-like細胞中的關鍵作用形成了較大反差。這說明儘管2C-like細胞在一些ZGA基因的表達上和2-細胞胚胎相似，但 2C-like細胞和2-細胞胚胎原則上是兩個不同的實驗模型。這一研究結果說明： 1）通過分析2C-like細胞得到的胚胎基因組激活結論仍需要在小鼠胚胎中進一步驗證；2）關鍵的負責2-細胞基因組激活的轉錄因子仍「在逃」。
專家點評
汪陽明（北京大學分子醫學研究所研究員）
當讀完張毅老師的這篇Nature Genetics 和3月份BioRxiv瑞士的Trono實驗室發表的文章（我得承認一個多月前先讀的BioRxiv）時，我陷入了一種既失落又欣喜的複雜情緒。2017年多篇Dux控制ZGA（受精卵基因組激活）程序的文章發表的時候，我也是這樣一種狀態，欣喜的是ZGA終於有了一個核心轉錄因子，失落的是為什麼做出這麼好的發現的不是我們。轉到今天，我的失落又變成了原來Dux也不是那個傳說中的核心轉錄因子，而我的欣喜則是我們還有很多人仍有機會去找到那個更重要的ZGA激活的開關轉錄因子。細想起來，Dux從神壇落地或許並不是什麼不可預期的黑天鵝事件，兩年前的文章畢竟大多用的是細胞模型，只有Trono實驗室直接在胚胎中做了敲除試驗，但也只是體外培養的受精卵。可是要回答生命中第一波最重要的轉錄事件究竟是誰控制的，最終還是要真刀真槍地在動物模型中去做，不是嗎？這兩篇文章用敲除小鼠模型（同樣的背景B6D2F1）不約而同地對曾經預想的Dux的重要作用說了No，儘管具體的表型稍微有些不同，Trono實驗室在Dux-/- X Dux-/-的實驗中得到了更少的產仔數，並且出現了部分新生小鼠被母鼠吞噬的「鼠倫」悲劇，但畢竟在Dux完全不存在的情形下，有諸多小鼠胚胎順利激活了受精卵基因組，更有一些小鼠個體成功活了下來。有人或許感到疑惑，一個基因（其實不是一個，是一串，因為Dux有多個重複並排在大約160kb的區域）的敲除，沒有什麼大不了的表型，為什麼還能發在一個相當decent的雜誌上呢? 有人會說，你看最後一個作者不就知道了，是大牛啊。我知道張毅老師當然是大牛，不過我不這麼看這個問題，我想的是兩年前的文章給了這個領域一個未經證實的幻想，而今年的這兩篇文章針對一個重要的問題戳破了那個泡泡，正了視聽，讓很多人對找到那個終極激活因子重新燃起了鬥志和希望。可是問題來了，控制受精卵基因激活就必須有一個核心轉錄因子嗎？生命的起始如果只依賴於命懸一線是不是太草率了？或許有許許多多的冗餘因子一起控制著這個過程，畢竟生不出仔來，一個物種再強大，也都到頭了。感謝這兩個嚴謹工作的以正視聽，讓我們明白，在受精卵基因組激活研究領域，「革命尚未成功，同志仍需努力」，還讓我們明白，in vitro儘管容易做一些，但要下定論，in vivo是必須的。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41588-019-0418-7
製版人：小嫻子
參考文獻
1. Lu, F. et al.Establishing Chromatin Regulatory Landscape during Mouse PreimplantationDevelopment. Cell 165, 1375-1388, doi:10.1016/j.cell.2016.05.050 (2016).
2. Gao, L. et al. Chromatin AccessibilityLandscape in Human Early Embryos and Its Association with Evolution. Cell 173,248-259 e215, doi:10.1016/j.cell.2018.02.028 (2018).
3. De Iaco, A. et al. DUX-familytranscription factors regulate zygotic genome activation in placental mammals. Nature genetics 49, 941-945, doi:10.1038/ng.3858 (2017).
4. Hendrickson, P. G. et al. Conservedroles of mouse DUX and human DUX4 in activating cleavage-stage genes andMERVL/HERVL retrotransposons. Nature genetics 49, 925-934, doi:10.1038/ng.3844(2017).
5. Whiddon, J. L., Langford, A. T., Wong,C. J., Zhong, J. W. & Tapscott, S. J. Conservation and innovation in theDUX4-family gene network. Nature genetics 49, 935-940, doi:10.1038/ng.3846(2017).
推薦閱讀：
