撰文 | 陳皮

責編 | 兮

近年來，由核酸酶介導的靶向基因組編輯技術發展迅速，CRISPR/Cas9基因編輯系統以其簡便性、高效性等特點而備受關注。CRISPR/Cas9系統對致病基因突變進行糾正通常是利用DNA同源重組修復來實現的，該過程需要同時提供一個外源DNA作爲供體以重新編碼DNA序列達到基因編輯的目的。但伴隨而來的，有諸如低切除頻率和潛在的序列重新整合等問題【1】。

DNA雙鏈斷裂（Double-strand breaks, DSBs）的修復通路主要有非同源末端連接修復（Non-homologous end-joining, NHEJ）和同源重組修復（Homologous recombination, HR）兩種。除此之外，還存在不常用的選擇性非同源末端連接修復（Microhomology-mediated end joining，MMEJ，也叫Alternative-NHEJ, Alt-NHEJ），它主要利用損傷區域的微同源片段（2-25 bp）發生退火反應，切除非同源ssDNA（single-strand DNA），最後將斷裂的DNA重新連接在一起【2】。MMEJ修復斷裂的DNA常會造成連接處發生微同源片段的缺失甚至導致基因重排，因此是一種易錯的修復方式。研究表明，MMEJ途徑存在於植物、細菌、人類等多種類型細胞中，同時MMEJ途徑也被應用在對哺乳動物細胞、斑馬魚和青蛙胚胎中定向插入外源性供體DNA的研究中【3-5】。那麼，基於HR途徑進行的基因編輯所帶來的困難能否通過利用MMEJ途徑得到改善？

2019年4月4日，來自於美國馬薩諸塞大學醫學院的Scot A. Wolfe團隊和Charles P. Emerson Jr團隊合作在Nature在線發表了一篇題爲Precise therapeutic gene correction by a simple nuclease-induced double-stranded break的文章，描述了一種簡單有效的基因糾正療法，即利用Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）核酸酶系統對基因組上致病性微重複中心附近區域通過MMEJ通路進行修復編輯，以實現精準回覆野生型基因序列的目的。

在本文中，研究人員選擇了兩種均爲常染色體隱性遺傳但是由不同長度的致病性微重複造成的疾病模型：肢帶型肌營養不良2G型( limb-girdle muscular dystrophy type 2G, LGMD2G)和白化病亞型Hermansky-Pudlak綜合徵1型(Hermansky–Pudlak syndrome type 1, HPS1)，設計試驗以評估基於MMEJ的修正方式的有效性【6,7】。

在LGMD2G患者東亞人羣中，存在一種疾病等位基因TCAP突變，其1號外顯子中存在着8-bp的微重複序列，突變頻率爲1/1000。正常情況下其編碼TCAP蛋白（Telethonin），綁定於肌聯蛋白Z1-Z2區，在調節肌原纖維的組裝中起到重要作用。研究表明，在青春期晚期到成年早期易發TCAP的純合或者雜合突變從而導致個體嚴重的肌肉萎縮和心肌病。研究人員獲得了來源於LGMD2G病人TCAP微重複純合突變的iPS細胞，針對TCAP上8-bp微重複，研究人員設計了靶向sgRNA以期產生避開微重複中心的一個鹼基對斷裂（圖1）。

圖1 致病性8-bp微重複TCAP(粗體紅色和藍色文本)。紅色框內爲SpCas9 PAM序列，下劃線爲前間隔序列.紅色箭頭表明誘導DSB的位點，半紅半藍文本爲修復後的野生型序列

通過電穿孔方式將純化的SpCas9與sgRNA(RNP)複合體導入iPS細胞內。深度測序分析結果表明基因組特定區域上發生了大約80%的indel（insertions and deletions），表明SpCas9 RNP能有效的在設計位點產生雙鏈斷裂。對序列變異樣本進一步的分析表明平均約有57%的等位基因包含了與野生型等位基因相同的精確的8-bp 刪除後的序列。此外，SpCas9 RNPs不會對TCAP等位基因造成可測量的過度編輯，這也表明突變細胞中經過修正的等位基因不會因爲意外的損傷而導致MMEJ修復逆轉。22株經核酸酶處理的LGMD2G iPS細胞克隆基因型鑑定結果表明77%的iPS細胞含有至少一個野生型等位基因，說明大部分經處理的細胞實現了基因糾正。對iPS來源的成肌細胞進行同樣的試驗，約45%的等位基因可以被精確的糾正爲野生型序列。對兩種細胞體外基因糾正試驗的成功爲通過在微重複中合適的區域引入一個DSB進行精確修復在體內的治療提供可能。

同樣的，研究人員對HPS1疾病模型也進行了體外驗證實驗。HPS1患者其基因第15個外顯子上存在着16-bp的致病性微重複。HPS蛋白參與溶酶體相關的細胞器複合物的生物發生過程，HPS1突變病人患有白血病、失血癥、進行性肺纖維化等疾病，從而導致過早死亡。研究人員獲得了患者來源的16-bp微重複純合突變B淋巴細胞系（B-LCL），利用SpCas9 RNPs系統對特定區域進行兩個鹼基對切除，發現同樣也存在一定比例的突變等位基因回覆。同時，對微重複區域上的靶向切割位點的選擇和可選擇性微同源區域的存在會影響預期的正常回復產物的產生。

緊接着，研究人員發現抑制DNA修復因子PARP-1會降低MMEJ的修復效率，說明MMEJ通路是LGMD2G和HPS1模型中單個靶向DSB產生後對微重複進行穩定校正的基礎（圖2）。

圖2. 兩種DNA DSB修復途徑示意圖

DSB產生的不同DNA雙鏈末端決定了不同的修復途徑。NHEJ通路是大多數細胞中占主導地位的DSB修復通路。MMEJ通路通過末端切除來發現斷裂兩側的微小同源序列，這些同源序列可用於模板化斷裂端融合。PARP-1可通過MMEJ通路調控DSB修復。用PARP-1抑制劑rucaparib治療細胞可降低DSB在MMEJ修復通路中的通量。

最後，研究人員證明了無論是利用Cas9體系抑或是Cas12a體系，基於MMEJ的編輯方法可以有效的應用於長度達到至少36-bp的微重複區域的靶向編輯。

總的來說，本項研究通過大數據分析和生物學實驗結合的手段闡述了針對致病性微重複突變引發的疾病，通過MMEJ途徑進行精確修復是一種很好的替代同源重組定向修復的方法。隨着人類基因組和表型研究數據的不斷積累，利用大數據分析或許可以發現能夠通過基於MMEJ方式進行基因編輯糾正的新型致病性微重複。雖然該方式潛在的機制以及是否存在該方式特異性治療的細胞尚未明確。但是本項研究爲尋求基於MMEJ對例如LGMD2G，HPS1以及其他由微重複造成的疾病的治療方法奠定了基礎。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1076-8

1. van Overbeek, M. et al. DNA repair profiling reveals nonrandom outcomes at Cas9-mediated breaks. Mol. Cell .63, 633–646 (2016).

2. Bae, S., Kweon, J., Kim, H. S. & Kim, J.-S. Microhomology-based choice of Cas9 nuclease target sites. Nat. Methods 11, 705–706 (2014).

3. Kim, S.-I. et al. Microhomology-assisted scarless genome editing in human iPSCs. Nat. Commun. 9, 939 (2018).

4. Hisano, Y. et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Sci. Rep. 5, 8841 (2015).

5. Sakuma, T., Nakade, S., Sakane, Y., Suzuki, K. T. & Yamamoto, T. MMEJ-assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR–Cas9 with the PITCh systems. Nat. Protoc. 11, 118–133 (2016).

6. Moreira, E. S. et al. Limb-girdle muscular dystrophy type 2G is caused by mutations in the gene encoding the sarcomeric protein telethonin. Nat. Genet. 24, 163–166 (2000).

7. El-Chemaly, S. & Young, L. R. Hermansky–Pudlak syndrome. Clin. Chest Med. 37, 505–511 (2016).

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