哺乳動物細胞蛋白表達（二）
真核表達載體
人工構建的哺乳動物細胞表達載體為穿梭載體，具體構成如下：
1.原核DNA序列：大腸桿菌複製子及抗生素抗性基因，便於載體在原核細胞中擴增和大量製備。
2.轉錄相關元件：哺乳動物細胞中有效轉錄的啟動子和增強子元件，以及終止子和加polyA信號序列。
3.翻譯相關元件：有效的mRNA翻譯信號。
4.其它：視實驗需要加入標誌基因、內含子、內部核糖體進入位點等。
表達系統
人根據目的蛋白表達的時空差異，可將表達系統分為瞬時、穩定和誘導表達系統：
瞬時表達系統是指宿主細胞在導入表達載體後不經選擇培養，載體DNA隨細胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達時限短暫。瞬時表達系統的優點是簡捷，實驗周期短。
穩定表達系統是指載體進入宿主細胞並經選擇培養，載體DNA穩定存在於細胞內，目的蛋白的表達持久、穩定。由於需抗性選擇甚至加壓擴增等步驟，穩定表達相對耗時耗力。
誘導表達系統是指目的基因的轉錄受外源小分子誘導後才得以開放。
穩定表達細胞系的篩選
1.構建目的基因的表達載體。
2.確定受體細胞（宿主細胞）。
3.確定篩選方法（抗生素的使用濃度）。
4.轉染後48h，傳代鋪板（1:100），加篩選藥物。
5.3~4d換液1次，直至存活細胞長出島狀細胞簇，約兩周。
6.克隆耐葯細胞，檢測目的基因的存在與表達。
表達系統的選擇
對於一個表達實驗，選擇何種表達系統應根據實際需要來決定：
1.表達蛋白的需求量
2.表達蛋白的用途
3.實驗所需時間
4.對細胞的毒性
選定表達系統之後，還需考慮表達載體與宿主細胞的合理搭配問題。
哺乳動物細胞表達系統中，重組蛋白的表達水平與許多因素相關，因此如果需獲得一個基因的高表達，最好多試用幾種不同的載體及宿主細胞。
影響蛋白表達的因素
重組蛋白表達量取決於總活細胞密度和單位細胞生產率。
培養環境中營養和生長因子缺乏、缺氧、病毒感染、毒性代謝物的積累、機械攪動以及培養壓力的增加等很多固素都可誘導細胞凋亡，大量細胞的死亡嚴重影響蛋白的表達產量。
在細胞大規模培育過程，細胞的持續大量增殖使蛋白表達很快進入衰退期，因此必須控制細胞在達到最適表達產物期停止增殖。
誘導表達系統中誘導物對細胞的毒性。
宿主細胞與表達載體的選擇。
提高蛋白表達產量的措施
為提高總活細胞密度（IVCD）宿主細胞改造著眼於抑制細胞凋亡、加快細胞增殖、增加細胞生長速率和提高最大活細胞密度等。
在提高單位細胞生產率方面，宿主細胞改造通常從蛋白質摺疊、運輸、修飾、分泌等方面著手。
抗凋亡工程：細胞死亡主要包括壞死和兩種程序性細胞死亡即凋亡和自噬，目前主要有兩種策略構建抗凋亡細胞，增加抗凋亡基因的表達和抑制促凋亡基因的表達。
代謝工程調控：優化培養工藝，降低細胞培養過程中氨和乳酸等代謝產物的累積，改善細胞生長環境，提高細胞生長密度，進而增加重組蛋白的產量。例如半乳糖可代替葡萄糖作為碳源，可以減少乳酸的產生；利用基因工程手段敲除代謝途徑中的關鍵調節蛋白（LDH等）。
細胞周期工程：通過調控細胞周期過程中的關鍵激酶，抑制細胞周期的進程G1/G0,G2/M或者G1 /S(其中G1/S期最普遍)，降低增殖速率，使細胞停滯在一個靜止狀態，增強代謝活性，提高蛋白表達水平。例如四環素抑製表達系統。
促分泌工程：內質網固有蛋白在蛋白的摺疊和分泌進程中起到重要的作用，提高細胞內翻譯後修飾過程中相關蛋白的表達，有助於改善重組蛋白的分泌。
優化宿主細胞和表達載體，提高蛋白表達水平和產量。
培養基的優化:目前，工業生產常用的細胞培養工藝有分批培養、流加培養和灌流培養等。其中，流加培養操作簡單、靈活，已經成為大規模動物細胞培養中最有競爭力的培養模式之一。
針對流加培養工藝的培養基開發，包括基礎培養基開發和流加培養基開發，同時還包括流加策略的選擇。考慮到傳染性海綿狀腦病及其它污染，通常會避免使用血清和動物源性添加劑。目前，全化學組分培養基一般含有氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽、脂質、胰島素或胰島素樣生長因子等組分。生物工程要求使用第三代無血清培養基，即無血清無蛋白(或含量極低)的雙無培養基，使細胞培養很容易做到恆定，細胞分泌的的蛋白更易分離純化，培養基的成本大為下降。
四環素調控表達系統
外源基因和抑制細胞生長的基因(如p27)在同一個雙順反了表達單位，在可調節的啟動(Tet-off)作用下使細胞增殖期與增殖抑制產物表達期分開，細胞生長和產物表達都能達到最大程度。Tet-off基因表達系統的優點在於毒性低，作用快，不影響哺乳動物細胞的代謝過程。由於四環素很不穩定，易於氧化、脫水、芳香基化和表易構化作用，使Tet基因表達系統成為一個高效、無毒、具有嚴密開關功能(Tc} switch)的可誘導性基因表達系統，僅受四環素初濃度的影響，終產物中四環素自發降解，有利於下游的純化過程。
未來研究方向
探討一些陸續發現和純化的糖蛋白和具有複雜結構(如多亞基)的蛋白的表達以及與天然蛋白的比較，包括生物活性、物化性質甚至一級結構。
提高表達水平。這是哺乳動物表達系統的關鍵問題。目前看來，仍然需要從以下途徑進行研究：
1.除現有的MT啟動子、熱休克啟動子、病毒啟動子，應發展一些新的強啟動子。
2.尋找合適的增強子，特別是細胞增強子。
3.提高基因劑量的新途徑。因dhfr放大子(amplicon)只能用於CHO dhfr-細胞株。
4.選擇載體-宿主的最優組合。
5.裝配適合於cDNA高效表達的必要元件。因目前cDNA在哺乳動物細胞中表達水平一般均低。
6.大規模培養條件和無血清及無蛋白培養條件的探索也是與哺乳動物細胞表達系統密切有關的問題，但這是屬於另一領域的課題。其中值得提及的是研究某些生長因子基因在導入哺乳動物細胞後，其表達產物有可能使細胞脫離血清生長，這一途徑對於哺乳動物細胞基 因工程具有很大的吸引力。
原文：哺乳動物細胞蛋白表達（二）
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