G蛋白偶聯受體（GPCR）由多種內源和合成配體調節，代表人類基因組中最大的可藥物靶標家族。最近的結構和分子研究已經轉化和擴展了受體藥理學的經典概念，並開始闡明結構，化學和功能多樣的配體調節GPCR功能的獨特機制。這些對配體參與和作用的分子見解使得新的計算方法成為可能並加速了新配體和工具化合物的發現 - 特別是對於未經研究的和孤兒受體GPCR。這些進步有望簡化GPCR靶向藥物的開發。

【2012諾貝爾獎】化學獎深度解讀：G蛋白偶聯受體的43年?

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導論

GPCR是7-跨膜整合膜蛋白，其通常將細胞外刺激轉化為細胞內信號。GPCR活化通常由激動劑結合介導，其穩定受體構象，其募集並最終激活細胞內轉導物。GPCR激動劑配體在物理和化學上是多樣的，可包括：光子; 離子（H +，Zn ++，Ca ++等;）; 增香劑; 味覺元; 維生素（如煙酸，維生素A1醛等）; 肽類和非肽類激素（雌激素，血管緊張素等）; 蛋白質（如趨化因子），神經遞質（多巴胺，血清素等）; 天然產物（嗎啡，salvinorin A等）; 大量中間代謝產物（ATP，ADP，脂肪酸，膽汁酸等）; 來自人類共生細菌的產品[參見（Allen et al。，2011a ; Roth et al。，2015）的評論]。在細胞內，GPCR活化被轉化為通過異三聚體G蛋白，抑制蛋白（Luttrell等，1999），激酶（Benovic等，1989）離子通道和各種支架蛋白介導的各種信號（Brown等，2003）（圖1）。在這種情況下，抑制蛋白的作用是消除G蛋白介導的信號傳導（ Lohse等，1990），作為通過網格蛋白包被的囊泡進行GPCR內化的支架（ Goodman等，1996）和作為信號傳導的支架（Luttrell等，J.Biol.Chem，1972,1987，1999）（圖1）。

圖1：不同的配體穩定的GPCR構象引起包括G蛋白和抑制蛋白在內的不同信號轉導物的結合和活化。β的（左）晶體結構2連接到GαsAR（淺藍色卡通）（藍色）Gβ（橙色）Gγ（綠色）異源三聚（PDB ID：3SN6（。Rasmussen等人，2011B））示出了G蛋白介導的信號。異源三聚體激活後，亞基解離並且Gα通過Gα介導的腺苷酸環化酶活化調節第二信使產生，例如cAMP產生。Gβγ調節單獨的Gα非依賴性下游信號傳導網路，例如離子通道，磷脂酶和受體激酶。

（右）結合β-抑制蛋白（鮭魚）的視紫紅質（淺藍色卡通）的晶體結構（PDB ID：4ZWJ（Kang等，2015））說明了抑制蛋白介導的作用，例如受體內化或激酶信號傳導網路的激活。

GPCR，其中人類超過800（Fredriksson等，2003），是人類基因組中最大的膜蛋白家族。已經使用了幾種GPCR分類方案，在本綜述中，我們將遵循當前的國際藥理學聯合會（IUPHAR）分類，其中包括五個主要家族：視紫紅質家族（A類），Secretin家族（B類），谷氨酸家族（C類），Frizzled / Taste系列（F類）和粘附系列[詳見]（Alexander et al。，2015）。在這篇綜述中，我們重點介紹了GPCR中配體相互作用的見解如何改變分子藥理學和藥物發現。

GPCR對生理學，疾病和治療的重要性

截至2017年，20％至30％的FDA批准的藥物針對GPCR（Rask-Andersen等，2011）。GPCR作為藥物靶標的普及主要是由於它們的生理學相關性，因為GPCR在大多數身體組織中表達，參與細胞通訊，並且通過GPCR介導的信號轉導參與人體生理學的幾乎所有方面; 以及它們的可藥性，因為GPCR具有有益的物理化學性質的結合口袋，這有助於藥物樣小分子的設計（Mason等，2012）。涉及GPCR的特別突出的治療應用（見圖2A）包括阿片類鎮痛葯（μ阿片受體; OPRM1受體激動劑），抗組胺葯（HRH1-組胺拮抗劑），抗膽鹼能葯（CHRM拮抗劑），典型和非典型抗精神病葯（D2多巴胺受體拮抗劑; DRD2），抗偏頭痛葯（5-HT1D 5-羥色胺能激動劑; HTR1D），β2激動劑用於治療哮喘（ADBAR2）和抗高血壓葯（靶向α 1腎上腺素能和血管緊張素II受體; ADAR1，ATGR1）。

圖2：GPCR一些批准和上市藥物的廣泛目標，以及配體如何揭示未知的GPCR生理學對潛在的治療應用。（A）球體大小對應於突出的治療性GPCR靶標的批准藥物的數量，其中拮抗劑，激動劑和負變構調節劑分別以紅色，綠色和藍色顯示。GPCRome的系統發生樹突出了目前被批准的藥物靶向的小部分GPCR。

（B）顯示了用於鑒定各種受體的先前未知藥理學的化合物的代表性實例及其結構。

GPCR蛋白組學的系統發生樹突出了被鑒定為脫靶的GPCR的多樣性。

除了作為藥物發現的治療靶標之外，GPCR變體偶爾也與疾病過程有關。實際上，數十種單基因疾病與組成型激活突變（CAMs）有關，這增加了GPCR的組成性活性。這些包括由視紫紅質CAM引起的先天性靜止性夜盲症（McAlear等，2010），半胱氨醯白三烯受體2的CAM的葡萄膜黑色素瘤（Moore等，2016）和許多其他條件（Smit等， 2007）。另外，功能喪失的GPCR突變偶爾與人類疾病有關。例如，V2-加壓素受體突變與腎性尿崩症有關（Pan等， 1992已經提出通過作為藥理學伴侶的作用拯救V2-加壓素受體突變體的錯誤摺疊表型的藥物作為治療劑（Morello等，2000）。

GPCR作為治療藥物發現中的有害脫靶

GPCR也是頻繁的藥物「脫靶」，其顯示出不可預測的相互作用，這可能導致意外的治療（Roth等，2004）或危及生命的副作用（Rothman等，2000）。最臭名昭著的例子可能是抗肥胖葯芬氟拉明，由於與許多人的心臟瓣膜病相關而被撤回（Allen等，2011a ; Roth，2007）。多年後，氟苯丙胺被廣泛宣傳退出全球市場，法律賠償總額超過100億美元，發現該化合物的代謝物 - 去甲氟尿嘧啶激活心臟5-HT 2B血清素受體，最終導致心臟瓣膜病（Rothman等，2000）（Roth，2007）。從那時起，由於類似的5-HT 2B介導的瓣膜性心臟病併發症，已經撤回了幾種藥物（Roth，2007）（Allen等，2011a）。

由於GPCR代表針對激酶和其他非GPCR分子靶標的藥物的頻繁脫靶，因此化合物通常在人類臨床試驗之前針對大量克隆的GPCR進行分析（Allen等，2011a）。重要的是，已經通過GPCR分析發現了索拉非尼和許多其他批准的和研究性激酶抑製劑對5-羥色胺能，嘌呤能和其他GPCR的有效作用（Elkins等，2016）。藥物靶標信息的大型資料庫也有助於通過GPCR識別藥物的潛在重要脫靶行為，包括ChEMBL（ebi.ac.uk/chembl/),PubChem( https：// pubchem .ncbi.nlm.nih.gov /），PHAROS（pharos.nih.gov/idg/inde）和Ki資料庫（kidbdev.med.unc.edu/dat）。這些化學信息學數據集也可用於計算機模擬預測和體外和體內確認GPCR作為相關和重要的藥物脫靶（Keiser等，2009）

未經過研究和孤兒的GPCR及其治療潛力

雖然有超過350種GPCR靶向FDA批准的藥物，但它們僅針對潛在可藥物GPCR領域的一小部分（Roth等，2015）（Rask-Andersen等，2011）（圖2A）。目前大約100種人類GPCR是晚期臨床前開發的活性靶標，並且總共將近400種小分子作為治療劑被積極研究（Lafferty-Whyte等，2016）。然而，目前的藥物開發主要針對那些作為潛在治療靶點進行廣泛驗證的GPCR（Lafferty-Whyte等，2016））。相反，只有少數孤兒或未充分研究的GPCR，「oGPCRs」 - 如i所定義）其出版物數量相對較少，ii）注釋小分子相互作用的數量較少，或者iii）缺乏已知的內源性配體（Roth等。，2015） - 目前正在調查治療藥物的發現。值得注意的是，據報道，Adhesion，Tastant和Frizzled受體家族在臨床試驗中沒有注釋小藥物樣分子（Lafferty-Whyte等，2016）。缺乏針對oGPCR的藥物開發計劃主要源於風險規避，因為對oGPCR的生理作用和藥物治療知之甚少。雖然敲除研究和用化學遺傳突變體GPCR替代，例如DREADDs（由設計藥物完全激活的設計者受體）（Roth，2016），或用於光遺傳學研究的嵌合視蛋白，如OptoXRs（Airan等，2009），代表確定oGPCR基本生理作用的策略，最大的瓶頸仍然是缺乏化學工具化合物來可靠地表徵體外和體內受體功能。然而，oGPCR已成為天然產物和合成藥物的重要受體; 靶向oGPCR的藥物已被用作闡明oGPCR介導的基本生物過程和治療方法的工具（圖2B）。例如，天然存在的致畸原環巴胺（Cooper等，1998）促進了作為hedgehog信號傳導途徑調節劑和癌症化療靶標的平滑受體（SMO）的鑒定（Rudin等，2009）。同樣，來自鼠尾草Salvia divinorum的迷幻劑salvinorin A 是一種選擇性κ-阿片受體激動劑的發現，證實該受體是精神模擬化合物的靶標（Roth et al。，2002））。發現幾種苯並二氮雜卓也會激活GPR68，這表明這些抗焦慮藥物的一些副作用可能是由這種受體介導的（Huang等，2015b）。此外，在TAAR1痕量胺受體上發現苯丙胺作用（Bunzow等，2001），發現TAAR1是神經精神疾病的潛在靶標。內源性TAAR1激動劑稱為甲狀腺素（Scanlan等，2004）揭示了痕量胺受體作為代謝，產熱和神經過程的潛在介質。顯然，擴大我們對GPCR目標和非目標藥理學的理解對於成功的藥物發現以及闡明健康和疾病中的基本生物和化學過程都很重要。然而，正如oGPCR所示，我們仍遠未對GPCR生物學進行全面的分子和生理學理解。接下來，我們回顧最近來自晶體結構的分子見解如何轉化經典受體藥理學，並促進我們對配體調節GPCR功能的機制的理解。我們進一步強調了配體在鑒定和表徵難以理解的GPCR的生理作用方面的效用，並提供了計算上利用分子洞察力鑒定新GPCR配體的當前進展的概述。

以結構為基礎理解GPCR配體藥理學

關鍵的藥理學概念

從歷史上看，激動和拮抗的概念源於對孤立器官的藥物作用的觀察。乙醯膽鹼的有序和常規激動劑活性突出了一個例子，其被阿托品拮抗（Clark，1926）。像這樣的觀察導致最初的概念，即激動劑誘導或穩定受體的活性狀態，而拮抗劑對它們自身沒有影響但阻止激動劑獲得這種受體。一旦GPCR被克隆並在體外表達，觀察到GPCR也具有不同程度的基礎或組成型活性。並且可以在沒有配體的情況下填充活躍的信號傳導狀態。除了一些值得注意的例外（例如粘附，凝血酶和一些病毒受體，如KHSV相關受體），GPCR通常需要外源激動劑來穩定最大信號的完全活躍狀態。內源性激動劑如神經遞質或激素通常但不是總是最大程度地激活其同源GPCR並被認為是完全激動劑（參見專欄1）; 不誘導100％活化的激動劑被定義為部分激動劑。重要的是要注意，當受體儲備時，部分激動劑可以表現為完全激動劑存在，並且即使並非所有受體都被佔用，也可以引發系統的完全響應。另一方面，拮抗劑是阻斷激動劑活性的化合物（天然存在的或合成的）; 拮抗劑被分類為反向激動劑（降低組成性活性的拮抗劑）或中性拮抗劑 [抑制激動劑作用但不干擾組成性活性的拮抗劑; 方框1，進一步詳情見（Roth，2016）]。

方框1

組織性活性由於活性受體狀態的自發群體，在沒有配體的情況下受體介導的信號傳導完全的激動劑在詢問途徑中引發最大信號的配體（內源性配體根據定義為完全激動劑）部分激動劑引起活動低於最高水平的配體逆向激動劑

抑制組成型受體活性的配體

中立拮抗劑結合受體但不影響組成型受體活性的配體受體儲備未與系統偶聯的受體通過僅激活總受體的一小部分而產生最大信號正構位點結合口袋容納內源性受體配體變構位點口袋不同於可以調節配體結合和受體活性的正構位點正負變構調節劑（PAM和NAM）

PAMs增加，NAMs響應正構配體降低受體的活性，同時結合不同於正位點的位點

雙聯配體具有正構和別構部分的配體功能選擇性/偏置信號配體在受體下游的不同途徑中賦予不同程度活化的能力運作模式受體激活的數學描述，以量化和預測藥物作用

激動劑，部分激動劑和拮抗劑與所謂的正構位點相互作用，所述正位點代表內源性激動劑通過其激活GPCR的結合位點。一些GPCR，特別是粘附（Hamann等人，2015）和蛋白酶激活受體（Coughlin，2000）缺乏經典的內源性激動劑，儘管在蛋白水解後，N末端片段佔據正位點。

另外，GPCR也可以通過在不同於正構位點的位點結合的分子進行變構調節。通常，變構調節劑分類為負變構調節劑或正變構調節劑（分別為NAM和PAM）（Christopoulos等，2014）（方框1）。變構調節劑不直接與正構位點相互作用，而是以負（NAM）或正（PAM）方式調節正構配體的功能。與正構和變構位點相互作用的分子被定義為位點配體並且可以是激動劑或拮抗劑。變構調節劑可以是內源性的，如幾乎普遍的變構調節劑鈉[NAM（Fenalti等人，2014）]和膽固醇[可以作為NAM或PAM 起作用的情況（Katritch等，2013）。 ]或外源天然產物或合成化合物（Kenakin等，1989）。GPCR配體也經常顯示功能選擇性或偏向信號 [ 框1 ; （Urban等，2007）]，一種過程，配體將信號指向或偏向一個或另一個途徑（圖1）。與此相關的是，雖然GPCR最初是根據它們相互作用的假定的主要G蛋白進行分類[例如Gs-，Gi-，Gq-和G12 / 13-偶聯（Simon et al。，1991）]，但模式被放棄了由於觀察到GPCR可以偶聯多種G蛋白（Asano等，1984）。許多理論模型已經出現，可以解釋激動劑，變構和拮抗劑的作用以及有偏見的信號，包括Black和Leff 的非常有用的雖然是現象學的操作模型（方框1）（Black et al。，1983）。這些簡化的模型仍然有用用於量化和預測GPCR的藥物作用（Kenakin等，2012）。隨著GPCR需要G蛋白激活的發現，出現了更詳細的模型，包括所謂的三元（De Lean等，1980）和擴展的三元複合模型（（Samama等，1993），以及其他結合抑制蛋白信號的模型（Roth，2016）（圖3）。簡單的三元和擴展三元複合物模型被稱為「三元」，因為它們具有三個成員：受體（R），配體（L）和hetereotrimec G蛋白（G）。包含其他效應物如抑制蛋白（圖3）的擴展版本正在通過更多機制方法得到驗證，這些方法將基於結構的見解納入配體藥理學。

圖3：分子和結構藥理學擴展了三元複合物模型，用於定量描述GPCR中的藥物作用。幾個配體結合非活性受體狀態（RL，R「L ...）和配體結合活性受體狀態（R * 1 L，R * 2 L ...），以及配體和效應結合活性受體狀態的三元複合物結構（ R * GL，R * AL）（PDB ID：3SN6（Rasmussen等人，2011b），PDB ID：4ZWJ（Kang等人，2015））在結構上通過X射線晶體學表徵。不同構象特徵，如A的鈉結合位點2A AR（PDB ID：4EIY（Liu等人，2012B）），納米抗體的離子鎖穩定β 2 AR（PDB ID：5JQH（ 。居留制等， 2016）），5-HT 2B受體的PIF基序（PDB ID：4IB4（。Wacker等人，2013），PDB ID：3NY8（Wacker等人，2010。 ）），以及納米抗體結合的β的NPxxY基序2AR（PDB ID：3NY8（。Wacker等人，2010），PDB ID： 3P0G（Rasmussen等，2011a）），突出了不同的GPCR活化狀態。

從概念的角度來看，三元（De Lean等，1980）和擴展（Samama等，1993）的複雜模型很重要，因為他們預測GPCR會自發地適應多個活性（R * 1，R * 2 ...）和非活動（R，R「...）構象。還如預測的那樣，這些瞬時狀態可以自發地與G蛋白或抑制蛋白轉導物相互作用以在不存在激動劑（R * E與E = G蛋白，Arrestin或其他轉導物）的情況下產生信號傳導複合物（圖3）。實際上，這種組成性活性已在重組（Burns等，1997）和內源（Arvanitakis等，1997）中得到充分記載。）表達系統。這些模型還預測拮抗劑不是簡單地「拮抗」GPCR，而是它們穩定無活性狀態（RL），從而通過充當反向激動劑來抑制組成型活性。該模型進一步預測所謂的中性拮抗劑可能是罕見的，因為任何配體都會至少在某種程度上偏向自發產生的構象的整體。拮抗劑實際上是反向激動劑的預測已在體外重組系統（Chidiac等，1993）和體內（Dillon等，2011）中得到廣泛驗證。）。這些模型還預測由激動劑（R * L）穩定的活性狀態可能與三元信號傳導複合物（R * GL; R * AL）的構象不同。這些預測已通過生化研究驗證，證明G蛋白結合變構增強激動劑結合親和力（Cerione等，1984）

分子見解對GPCR-配體相互作用的影響闡明了受體藥理學的經驗和經典概念

歷史上，描述結合相互作用的大多數初始功能概念基於在重組或內源系統中進行的配體結合和信號傳導研究的現象學觀察。直到技術進步通過X射線晶體學，核磁共振和其他生物物理測定研究配體 - 受體相互作用，高解析度見解才能實現這些不同狀態的分子表徵（圖3）。最初的生化研究表明，GPCR激活涉及螺旋運動（Farrens，1996）; 從那以後，晶體學和現在的低溫EM結構大大增強了我們對分子特徵的理解，這些分子特徵定義了不同的GPCR構象和信號狀態。大多數GPCR已經以明顯無活性的構象（RL）結晶，與拮抗劑或激動劑結合（Tesmer，2016）。這些非活性狀態結構突出了非活性GPCR的不同特徵，例如內源性NAM鈉的結合（Fenalti等，2014 ; Liu等，2012b），以及封閉的「離子鎖」（Staus等，2016））。已經針對5-HT 1B血清素（Wang等人，2013），A 2A描述了在沒有結合效應子（R * L）的情況下的中間活性狀態。腺苷（A 2A AR）（Allen等，2011b）和神經降壓素（White等，2012）受體。結合激動劑麥角胺的5-HT 2B血清素受體結構（Wacker等，2013）和麥角醯二乙胺（LSD）（Wacker等，2017）已經確定了抑制素偏向中間態的特徵（R *） L）。它們特別包括所選「觸發」基序的「活性樣」構象，包括PIF和NPxxY基序[ 圖3 ; 見（Venkatakrishnan等，2013）（Wacker等，2017）詳情]，這是許多GPCR中發現的對受體激活至關重要的結構元素。由納米抗體穩定的活性狀態受體結構特別有助於表徵GPCR活化的結構標誌（Huang等，2015a ; Kruse等，2013 ; Rasmussen等，2011a）。也已確定了三元信號複合物，如β的晶體結構2 AR具有激動劑和hetereotrimeric G蛋白（R * GL）（Rasmussen等人，2011B）中，用休止視紫紅質（R * AL）（Kang等人。，2015）（圖3）。最近的R * GL狀態的低溫EM結構（Liang et al。，2017 ;Zhang等人，2017）已經證實了一些β的關鍵特性2 AR-G蛋白複合物。最後，儘管與高解析度結構無關，但最近的一份報告表明，在某些情況下，GPCR，異三聚體G蛋白和抑制蛋白的megaplex可能作為功能性信號實體存在（Thomsen等，2016），基於內體的調節GPCR信號。因此，這些模型預測的幾種構象集合最終在結構上得到了揭示，並極大地提高了我們對GPCR活化和調節的分子理解。正如三元複合物模型的擴展版本所預測的那樣（Roth，2016 ; Samama等，1993）和生物物理學驗證（Manglik等，2015）存在多種額外的構象中間體。這些包括RL基態，它類似於非活性視紫紅質，它通過維持TM III中保守殘基（通常為Asn或Gln鹼性）和TM VI（通常為酸性）之間的完整離子鎖（Palczewski等，2000）。像Asp或Glu）。此外，活躍（R * L）和耦合（R * GL; R * AL）之間可能存在許多中間狀態（Manglik等，2015））受體。同樣，這些擴展模型預測存在無活性（R）和活性（R *）狀態的holo-GPCR複合物; 再次，這些構象中間體有新的生物物理學證據（Manglik等，2015）。最後，這些模型預測GPCRs和G蛋白可以以預耦合活性狀態存在（R * G）; 儘管直接結構研究尚未觀察到這些狀態，但有證據表明GPCR-G蛋白預解偶聯[RG; （Nobles等，2005）]。從先前討論的觀??察結果可以清楚地看出，GPCR存在多種中間構象狀態（單獨和與其效應子複合）; 闡明這些效應物的全部補充對於設計藥物以穩定獨特構象和信號傳導中間體的未來努力將是重要的。

配體識別的多種模式：正構，比特和變構GPCR-配體相互作用

雖然過多的先前結構功能研究發現了對許多GPCR的結合和活化至關重要的殘基，但配體-GPCR相互作用的分子細節仍然是推測性的，直到GPCR的第一個晶體結構，視紫紅質（Palczewski等，2000）提供最初的見解。當與內源性配體結合時，只有少數GPCR結晶：與視網膜複合的視紫紅質和其他視蛋白（Palczewski等，2000）（圖4），與mGluR的細胞外結構域複合的谷氨酸（Kunishima等。 ，2000），腺苷結合的A 2A AR（Lebon等，2011），神經降壓素結合的NT-1神經降壓素受體（White等人，2012），內皮素結合的內皮素ET 乙受體（Shihoya等人，2016），和腎上腺素結合的β 2 AR（環等人，2013）。由於視紫紅質是一個例外，因為它是共價結合到其內源性的配體，其中包括許多A類GPCR的共享一個更一般的正構結合位點的第一結構的證據來自A的結構來2A AR和β 2 AR結合到它們擴散的內源性配體（Lebon等，2011 ; Ring等，2013）。對於基於NT-1神經降壓素受體與神經降壓素複合物結構的肽能GPCRs和與修飾肽激動劑複合的δ-阿片受體結構，正位點位點可能與共享的A類正構位點重疊，並擴展到包括廣泛接觸細胞外環。最近的低溫-EM研究表明，幾種B類受體的內源肽佔據與A類受體相似的正位點，但似乎更喜歡更大和更長的結合口袋（Liang等，2017 ; Zhang等， 2017）。

圖4：不同GPCR-配體複合物的晶體結構突出了配體結合位點的不同位置。配體顯示為具有透明表面的棒狀模型，受體以淺藍色的卡通表示。複合物顯示視網膜結合的RHO，LY2119620結合的CHRM2，結合鈉的ADORA2A，麥角胺結合的HTR2B，CCR2-RA- [R]結合的CCR2，結合MK-0893的GCGR，結合CP-376395的CRHR1和BPTU-綁定P2RY1。

通常，A類GPCR的正構結合位點位於七跨膜螺旋束的中間，位於細胞外環和膜的中間平面之間。根據配體的性質，正構位點表現出不同的形狀和恆化組成。例如，更多的親脂性配體，例如大麻素，可能從膜進入受體，因此疏水性結合位點被來自細胞外環的殘基覆蓋，從而為親水性細胞外空間提供屏障（Hua等，2016）。相反，肽配體 - 特別是B類受體 - 通常很大並且具有相當大的靈活性（OConnor等，2015），並且需要對細胞外空間開放的正位點（梁等人，2017年 ; Zhang et al。，2017）。有趣的是，雖然正構位點的性質對於適應配體的恆化和空間特性至關重要，但通過受體特異性殘基網路進入結合位點可能是化合物結合的最大能量障礙（Dror等，2011）。該發現對於受體選擇性配體的設計和受體結合和解離速率的控制尤其重要。一些研究還提供了對結構不同的配體結合位點的關鍵結構見解，如在A類GPCR中所觀察到的那樣（圖4）。這些包括與位於前體激動劑結合位點上方的前庭中的PAM結合的M2毒蕈鹼受體（Kruse等，2013），並且促腎上腺皮質素釋放因子1受體與位於細胞質部分深處的假定的變構拮抗劑結合。螺旋束（Hollenstein等，2013）。還發現變構配體與趨化因子受體CCR9中Gα亞基C末端尾部的推定細胞內結合位點結合（Oswald等，2016））和胰高血糖素中的外螺旋結合位點（Jazayeri等，2016）和嘌呤能P2Y1受體（Zhang等，2015）（圖4）。最後，GPCR功能的一般變構調節劑包括膽固醇，其結合不同受體中不同的額外螺旋結合位點（Gimpl，2016）和鈉，其結合在位於正位點下方的螺旋束中心的高度保守的口袋中。 （Katritch等，2014）（圖4）。令人驚訝的是，儘管幾十年的工作探索GPCR變構調節（Kenakin等，1989 ; Lanzafame等，1997），目前批准的藥物主要針對正位點（圖2A）。僅存在少數FDA批准的GPCR變構調節劑：cinacalcet，鈣敏感受體（CASR）的NAM，maraviroc，CCR5趨化因子受體NAM（CCR5）和Smoothened受體（SMO）NAMs sonedigib和vismodegib。儘管數量有限，但針對GPCR的變構仍然是治療藥物開發的一種有前途的方法（Changeux等，2016），因為變構調節劑通常對其靶標具有更高的選擇性，並且變構調節內源性配體的作用提供了實質性的治療益處（Aitken等人，2009）。缺乏變構治療的一個重要原因可能是設計具有足夠功效的化合物具有挑戰性，因為對於大多數GPCR而言，只有正位囊已經進化以控制受體調節。值得注意的是，內源性離子，脂質，銜接蛋白和效應子調節GPCR功能（van der Westhuizen等，2015）），它們的相互作用的表面很少具有合成調節劑的結構通知設計所必需的理化性質。缺乏可用的變構調節劑的其他原因可能包括缺乏工具化合物，以及與開發用於測試變構調節的合適測定相關的困難。結合計算方法的晶體結構丰度的增加應該極大地促進潛在的變構位點和斑塊的識別和表徵，這反過來可以大大加速變構調節劑的目標設計。

有偏見的信號和動力學作為配體編碼活動的驅動因素

GPCR信號傳導具有上下文和動力學方面，這些可以被利用 - 最終從結構方法 - 到微調基礎科學和治療應用的信號。至於β經典所示2 AR，G蛋白信號通常發生內快速一秒鐘左右激動劑給葯的，而它通常僅持續幾分鐘。信號終止通過受體磷酸化，抑制蛋白結合和內化的脫敏發生（Lefkowitz等，2005）。相比之下，抑制蛋白結合和G蛋白非依賴性抑制蛋白信號傳導事件，如MAP激酶激活，通常發生在每分鐘到一小時的時間尺度上（Lefkowitz等，2005））。這兩種信號通路的描述導致了GPCR如何在正常生理和疾病中介導其作用的重大重新定義，並開創了GPCR藥物發現的新時代，以確定偏向於G蛋白的激動劑（White等， 2015）或arrestin（Allen等，2011b）發出信號，有望改善治療特性並減少副作用（DeWire等，2011）。然而，應該注意的是，GPCR效應子的鑒定和表徵仍然是一個活躍的研究領域（Paek等，2017），並且可能有許多未鑒定的細胞內蛋白與信號複合物相互作用並調節GPCR信號傳導（Paek等，2017）。從機械學的角度來看，儘管最近的結構和生物物理學研究已經開始澄清這個問題，但受體如何介導有偏見的信號仍然很不清楚。例如，抑制蛋白偏向的藥物麥角胺結合5-HT 2B血清素受體的結構（Wacker等人，2013）揭示了麥角胺如何穩定一種獨特的受體構象，其中抑制蛋白抑制信號傳導所必需的基序（例如NPxxY）被激活。而與G蛋白信號傳導相關的其他信號（例如DRY或PIF）保持在無活性狀態。NMR（Liu等，2012a）和熒光光譜研究（Rahmeh等，2012）強調配體如何選擇性地參與不同的基序以穩定GPCR構象，這更有利於將一種效應物容納在另一種效應物上。與特定途徑的信號轉導相關的GPCR構象進一步顯示依賴於配體結合率。在最近研究LSD與5-HT 2B和5-HT 2A血清素受體的相互作用中，發現緩慢的配體動力學對於抑制蛋白信號傳導是關鍵的（Wacker等，2017）。對D2多巴胺受體的研究進一步揭示了動力學如何調節偏倚信號的模式（Klein Herenbrink等，2016））。總之，這些發現突出了化合物結合水平的功能選擇性，不同受體構象的穩定性和細胞內信號進展的關鍵動力學成分，它們一起顯著影響細胞反應。具有差異模式的偏向信號傳導的藥物的開發和鑒定代表了研究的主要領域，因為這些化學工具有助於描繪GPCR的下游信號傳導網路，並且對於探索oGPCR的生理學作用特別有用。因此，例如，迷幻劑LSD（Wacker等，2017）似乎顯示出對β-抑制蛋白信號傳導的偏向（方框1，圖1），而合成阿片類藥物TRV-130（DeWire等，2013）和PZM -21（Manglik等，2016）偏向於G蛋白信號傳導（方框1，圖1））。變構調節劑在單個GPCR可與多個G蛋白相互作用的情況下也表現出偏向增強，如質子感應GPCR GPR68的情況（Huang等，2015b）。由於關鍵信號轉導物的差異表達，信號轉導以及因此信號傳導偏差將在細胞類型之間變化（Urs等，2016）。利用藥物發現的信號偏差有望產生大量改進的化合物，這些化合物特異性地靶向治療途徑，同時避免同一受體下游的病理事件（Allen等，2011b ; Violin等，2007）。

開發GPCR-LIGAND結構用於藥物發現

隨著GPCR結構數量的增加，我們可以通過為改進療法的結構引導設計提供平台來預測GPCR研究的新化學工具的產生。由於GPCR常常與配體複合結晶，因此結構引導的藥物設計是配體發現的經典方法的有前途的替代方案，其採用基於藥物化學的現有支架修飾循環。然而，儘管十多年來一直對蛋白激酶抑製劑進行真正的結構指導藥物發現和優化（Noble等，2004），但GPCR的成功實例卻很少見。例如，A 2A的基於結構的藥物設計AR產生了新的1,2,4-三嗪衍生物，其通過囊法顯示採用新的結合模式（Congreve等，2012）。類似地，最初通過基於片段的篩選和藥物化學的組合發現新的mGluR5代謝型谷氨酸受體NAM，並且隨後通過結晶學鑒定它們的結合模式（Christopher等人，2015）。值得注意的是，雖然這種結構引導的藥物發現和優化對於其他藥物靶標來說是相對常規的，其中幾種主要化合物與分子靶序列連續結晶，並且基於從結構獲得的見解合成衍生物，常規結晶GPCR仍然極具挑戰性。基於結構的GPCR新型化學型的虛擬發現GPCR結構的可用性激發了大量成功的計算活動，旨在發現具有GPCR獨特化學結構（例如化學型）的新型化學探針（例如虛擬篩選）。最早的一個成功的是自動化的分子對接?β 2 AR的是產生納摩爾效力反向激動劑（Kolb等人，2009）。之一得到的化合物的結晶，當發現β的新穎2 AR的配體結合構象（Wacker等人，2010）。鑒於結構引導發現新GPCR配體的這一成功和其他成功，人們可能會問，是否有可能使用分子模型代替實驗確定的結構作為其他受體對接的模板。這種方法與D3多巴胺受體的一個早期的例子（Carlsson等人，2011）功能最初停靠針對所使用的βD3多巴胺受體的同源模型330萬個化合物2 AR作為模板。發現了幾種納摩爾效力拮抗劑。還使用D3受體X射線結構作為模板進行對接（Chien等人，2010並且，令人驚訝的是，鑒定了一組獨特的納摩爾效力拮抗劑。從這項練習中得出的結果是觀察到晶體結構取樣的略微不同的構象和該受體的模型產生了化學上不同的活性分子組。這種整體方法的一個令人興奮的擴展 - 可能證明可以提供模板的方法 - 是基於串聯結構引導和基於對接的活性分子優化成潛在的治療實體。在一個實例中，來自ZINC資料庫（Irwin等，2005）的300萬種市售化合物與μ阿片受體的無活性構象對接（Manglik等，2016）），嗎啡的分子受體。來自對接活動的初始先導化合物經過實驗測試，購買市售的類似物以獲得更高親和力的配體。然後通過適度的藥物化學優化活性化合物，在它們的對接姿勢，結構考慮和實驗藥理學的指導下。這一過程最終產生了PZM-21，一種具有適度G蛋白偏倚的選擇性高親和力μ阿片類激動劑，與嗎啡相比，最終被發現具有較少副作用的鎮痛作用（Manglik等，2016）。

結構激發的oGPCR化學探針的發現

該同源性模型可用於鑒定新的化學物質，使用虛擬配體篩選已被證明對oGPCR特別有用，對於oGPCR，常規配體篩選活動未產生有用的探針。例如，鑒定了oGPCR GPR68和GPR65的選擇性變構調節劑（NAM和PAM），並通過物理篩選和計算機對接的組合進一步優化（Huang等，2015b）。通過調節小鼠中的條件性恐懼反應，一種GPR68 PAM，ogerin被證明在體內具有靶向活性。最近已採用類似的方法鑒定oGPCRs GPR171（Wardman等，2016）和MRGPRX2（Lansu等，2017）的小分子配體。這些化合物隨後用於進一步分別表徵受體在攝食行為和瘙癢中的作用。

然而，同源模型的成功使用在很大程度上取決於模型的準確性。對接結果的分析是考慮從晶體結構驗證的關於配體 - 受體相互作用的先前生物化學和藥理學信息的過程。因此，對A類GPCR中配體結合可獲得的關鍵殘基的描述（Gloriam等，2009）或所謂的蛋白質 - 配體相互作用指紋的定義[綜述於（Vass等，2016）]，不僅大大增強了相關分子的鑒定，但也突出了使用工具化合物研究GPCRs相互作用和功能的重要性。另一種被稱為「扒竊」的方法，分析配體 - 殘基接觸強度，以確定非同源受體之間潛在的配體結合相似性。這種方法允許一個最近的一篇論文鑒定進行oGPCR GPR37L新化學型中，作者通過從具有足夠的化學物質，並表現出與GPR37L實質性的接觸強度相似食慾素和神經肽受體「偷」配體（He等，2016） （圖5）。綜合這些最近的成功表明，基於同源模型的方法可以是發現oGPCR的激動劑，拮抗劑和變構調節劑的有效且有用的方法。

圖5：計算機方法為GPCR產生新的工具化合物。如此處所示，「Pickpocketing」方法根據配體接觸強度通知口袋比對鑒定具有潛在相關配體結合特性的GPCR。神經肽S受體（NPS）和孤兒GPCR GPR37L1之間類似的配體結合特性鑒定出NPS受體配體SHA68作為詢問GPR37L1功能的新配體。該圖由Ngo等人（2017年）經許可進行了修改。

結論和未來方向

很明顯，過去10年見證了GPCR研究的復興，這些研究是通過對GPCR配體結合和信號傳導的最基本方面的結構性見解催化的。先前被認為是理論上的配體識別概念 - 例如變構調製（Kenakin等，1989） - 現在已經從結構和功能的角度得到了有力的驗證。此外，我們開始暗示不同的配體如何穩定不同的構象集合，導致多年前預測的各種活躍，無活性和偏倚狀態（Urban等，2007）。最後，過多的結構為計算生物學家提供了結構引導和結構啟發藥物發現的巨大機會。雖然從歷史角度考慮這些進步是驚人的，但我們對GPCR結構，功能，信號和藥理學的理解仍存在巨大差距。顯然，我們從機械的，分子的角度理解GPCR功能選擇性是不充分的，並且仍然是現象學的。因此，例如，沒有具有與G蛋白偏向激動劑複合的G蛋白的GPCR結構，也沒有具有與抑制蛋白複合的抑制蛋白偏向配體的GPCR結構。此外，有偏見的配體如何穩定不同的狀態尚不清楚，發現和開發此類配體的方法是發現而非機械為基礎。例如，考慮到雖然40多個GPCR的結構已通過X射線晶體學解決，但在大多數情況下，這僅通過一種配體實現，並且僅處於非活性狀態。對於一些受體，包括β 2 AR和A 2A AR多配體複合物是可用的，但結合口袋內只有很少的可塑性是顯而易見的。然而，在我們最近關於5-HT 2B受體的研究中，我們在檢查由類似化合物穩定的結構時觀察到GPCR結合口袋內的廣泛可塑性（Wacker等，2017）

根據前述內容，我們預測，根據檢測的特定GPCR和配體，將觀察到結合位點內的範圍構象重排。此外，很明顯，通常被認為是「不可遏制的」GPCR區域（例如細胞內環，界面等）（Oswald等，2016）是當前和潛在治療的作用位點。因此，了解和預測GPCR結合位點如何與特定配體複合變化，以及這些變化如何最終導致差異信號傳導和生理結果仍然是結構生物學家和分子藥理學家面臨的重大挑戰。

最後，儘管GPCR仍然是治療藥物發現最受歡迎的分子靶點家族，但目前的藥物靶向的GPCR數量極少。雖然藥物正在開發針對大約100個GPCR，但是我們對oGPCR的理解以及它們如何作為治療靶標仍然存在巨大差距。正如最近強調的那樣，對於人類基因組中超過一半的可藥用GPCR，關於它們在正常生理學中的作用的信息很少，而不是它們作為治療靶標的效用（Roth等，2015）。此外，許多GPCR通過未鑒定出真正的內源性激動劑而仍然是「孤兒」 （Roth等，2015））。雖然經典的敲除研究和/或化學和光遺傳學方法可以提供對oGPCR功能的一些了解，但它是迫切需要描述其生理作用的工具化合物，在分子水平上表徵它們的功能，並且可能由此鑒定新的治療劑目標。應用虛擬配體篩選等技術和各種計算方法從頭構建配體通過分子GPCR研究實現的，已經開始產生有價值的化學工具。隨著機器學習技術的實施，以更好地預測複雜生物系統中的複合活動，計算篩選的速度和成功率在未來幾年內可能會大幅增加。基於越來越多的GPCR結構，計算方法因此有望增加或甚至取代手動高通量藥物篩選，同時加速新工具化合物的產生以研究GPCR功能或開發藥物設計平台。合成或天然的配體是闡明GPCR機制和生理學的最有力工具，這些數據不僅有助於更好地理解單一最大類的膜蛋白。

參考文獻：

Wacker, D., Stevens, R. C., & Roth, B. L. (2017). How ligands illuminate GPCR molecular pharmacology.Cell,170(3), 414-427.


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