目前哺乳動物工程細胞能夠以前所未有的選擇性和靈敏度檢測多種可溶性抗原和表面結合抗原, 並且, 通過植入合適的相應模塊, 可以在動物模型中成功治療糖尿病，癌症和自身免疫病。最近, 使用嵌和抗原受體(CAR)-T細胞的第一批免疫療法被批准用於治療淋巴瘤。 這一里程碑式的事件預示著合成生物學方法的臨牀應用必將大放異彩。本文介紹了工程化改造哺乳動物細胞用於疾病診斷和治療的設計策略, 以及該領域的前景和挑戰。

原文以 Engineering mammalian cells for disease diagnosis and treatment發表在期刊 《Current Opinion in Biotechnology》。 本文內容節選自原文, 有刪改。

作者：高元力, 中國科學院大學生物系本科生

全文約2200字，閱讀時間約為6分鐘

合成生物學旨在重新編程細胞以使其感受各種輸入信號, 並在不同的條件下選擇地表達用戶設定的基因以作出響應。哺乳動物細胞, 作為底盤, 可以被改造以感受人類疾病信號,進行計算, 輸出易檢測的信號, 或實現適當的治療功能。本文總結了用於構建檢測可溶性分子或細胞表面結合分子的哺乳細胞的元件及設計策略。

可溶性分子(soluble-molecules)的檢測-響應迴路

1) 天然受體

檢測病理水平濃度的可溶性物質的最簡單的策略就是利用細胞自身的配體-受體結合機制, 並且通過對下游信號級聯通路的改造實現理想的響應。 G蛋白耦聯受體(GPCR) 和離子通道受體都可以用作這種信號的檢測與傳遞, 並通過下游的環磷酸腺苷(cAMP)通路和Ca2+通路激活下游的啟動子。

Figure 1. 天然受體

2) Tango

Tango是一種基於正交的、依賴於蛋白酶的細胞轉導模塊的迴路設計策略。 Tango由天然的或經人工進化的受體,跨膜且含有蛋白酶切位點的連接子(linker)和胞內的轉錄因子組成。 配體與受體結合後, 招募與蛋白酶融合的信號分子,蛋白酶剪切連接子並釋放轉錄因子, 激活特定基因的表達。 採用Tango策略, 不同的G蛋白偶聯受體(GPCR), 受體酪氨酸激酶(RTK) 和類固醇激素受體都可以與下游不同功能的基因相接合。另外, Kipniss等人將Tango的設計結構與dCas9-TF結合, 將蛋白酶與GPCR的C末端融合, 而將信號蛋白與dCas9-TF融合, 獲得了優於原Tango設計的功能[2]。

Figure 2. Tango

3) MESA

MESA受體包含2個與合成抗體相融合的抗體單鏈可變片段(ScFv), 一條ScFv鏈與轉錄因子通過含有含有蛋白酶切位點的肽鏈連接, 另一條ScFv鏈與匹配的蛋白酶融合。 當配體與受體結合後, 兩條鏈發生二聚作用, 蛋白酶水解肽鏈使轉錄因子釋放。與前兩種方法相比, MESA利用合成受體可以檢測更多種類、甚至天然受體未知的分子, 但是MESA在沒有配體的時候有顯著的本底活性, 而且在配體結合後的激活水平並不理想。

Figure 3. MESA

4) GEMS

GEMS (Generalized Extracellular Molecule Sensor)的結構基於與不同配體結合的結構域融合的促紅細胞生成素(erythropoietin)受體, 可以響應胞外多種類的分子。 GEMS受體的胞質部分含有可以特異性激活下游4個信號通路(JAK/STAT,ERK/MAPK, PLC 和 PI3K/AKT)的多個結構域,可以同時驅動多個轉錄程序。 相比基於MESA和Tango的方法, GEMS充分利用了細胞內級聯通路的信號放大作用, 且不再使系統的效果過度依賴於某個啟動子的選擇。另一方面, 由於GEMS可以較容易的改造以適應新的可溶性抗原, 其有望成為開發基於細胞的診斷或治療多種疾病的有效工具。

Figure 4. GEMS

細胞表面結合分子(surface-bound molecules)的檢測-響應迴路

1) CAR

CAR (chimeric antigen receptors, 嵌合抗原受體)由胞外的抗體衍生的scFv(抗體單鏈可變片段) 或納米抗體和胞內的調控結構域組成。 CAR是目前臨牀上應用的最為先進的T細胞工程平臺, 表達CAR的T細胞能夠檢測並攻擊表面帶有目標抗原的癌細胞。

Figure 5. CAR

2) SynNotch

SynNotch受體由相互正交的胞外和胞內結構域組成, 可以對輸入信號進行編程。SynNotch受體與臨近細胞中的表面抗原結合而被激活, 從而觸發合成的轉錄因子的蛋白水解釋放, 從而調控目標基因的表達。 這種嵌合抗體曾被用以檢測來自免疫抑制性的腫瘤微環境的抗原, 並表達免疫刺激分子以進行響應[3]。

Figure 6. SynNotch

SynNotch和CAR受體可以聯合起來限制T細胞的活化, 使得只有攜帶有兩種靶抗原的腫瘤細胞存在時T細胞才會發生活化。 通過如下圖所示的AND邏輯門, 第一種抗原激活synNotch受體, 進而激活CAR的表達, 而CAR可以檢測第二種抗原激活下游通路, 從而實現體內環境腫瘤識別的高選擇性。

Figure 7. synNotch 與CAR組成的與門

3) JAK/STAT-CD45 cell-cell contact pathway:

膜受體IL4與IL13的胞外結構域與scFv融合。 當與細胞表面抗原結合時, IL4和IL13受體部分發生異源二聚, 解除磷酸酶CD45胞內結構域對JAK-STAT信號傳導的阻斷, 通過STAT6誘導的信號轉導, 激活響應STAT6的啟動子表達選定的基因。 採用這種策略編輯的人間充質幹細胞, 可以特異的殺死表達有HER2(人表皮生長因子受體, 乳腺癌標誌物)的SKBR3乳腺癌細胞。

Figure 8. JAK/STAT-CD45 cell-cell contact pathway

前景展望與面臨的挑戰

1) 工程細胞擁有著在根本上改變現有的診斷、預防和治療疾病的方法的潛力。T細胞療法是第一個應用於臨牀的合成生物學方法, 而這註定只是工程細胞療法浪潮的第一朵浪花。而且最近隨著靶向癌細胞表面抗原的限制被打破, CAR T療法的應用範圍被拓展至可溶性抗原的檢測。這將允許T細胞識別實體瘤微環境中的可溶性蛋白質, 並對其產生治療性響應。

2) 對其他造成血液中生物標誌物濃度改變的疾病, 臨牀前的數據中主要是通過將工程細胞包封入藻酸鹽微囊(alginate beads), 然後植入鼠模型的血管外部採集的。一些更大尺度上包封細胞的技術(macroencapsulation)正在研發之中, 並且有可能在維持和發揮被包封細胞的功能和活力方面超過藻酸鹽封裝, 並且由於體積更大, 在有需要的時候檢查起來更加容易。 由於包封可以保護治療細胞免受患者免疫系統的侵害，因此非自體細胞與疾病的臨牀相關性應當與患者來源的細胞相同。 使用「現成的」(off-the-shelf)同種異體細胞可能是更具成本效益的療法。

Figure 9. 基因工程改造的哺乳細胞療法的體內實驗

3) 臨牀經驗的不斷增加不可避免的帶來更多挑戰。例如，至今仍缺乏具有快速響應特性的基因迴路，這種基因迴路將造福於患有糖尿病的患者。 為了實現幾分鐘的響應時間，這樣的基因迴路必須繞過基於轉錄的慢響應，而依賴於轉錄後水平的作用。 隨著工程細胞療法越來越接近患者的需求，將不斷會有令人興奮的新挑戰產生。

參考文獻:

[1]Ana P T , Martin F .Engineering mammalian cells for disease diagnosis and treatment[J]. CurrentOpinion in Biotechnology, 2019, 55:87-94.

[2] Kipniss N H , Dingal P C D P , Abbott T R , etal. Engineering cell sensing and responses using a GPCR-coupled CRISPR-Cassystem[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):2212.

[3] Roybal K T , Rupp L J , Morsut L , et al.Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-SensingCircuits[J]. Cell, 2016, 164(4):770-779.

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