活性中心的氨基酸按功能可分為底物結合部位和催化部位。前者負責識別特定的底物並與之結合。它們決定了酶的底物專一性。後者是起催化作用的，底物的敏感鍵在此被切斷或形成新鍵，從而生成產物。二者的分別並不是絕對的，有些基團既有底物結合功能又有催化功能。

Koshland將酶分子中的殘基分為四類：接觸殘基負責底物的結合與催化，輔助殘基起協助作用，結構殘基維持酶的構象，非貢獻殘基的替換對活性無影響，但對酶的免疫、運輸、調控與壽命等有作用。前二者構成活性中心，前三者稱為酶的必須基團。

活性中心以外的部分並不是無用的，它們能夠維持酶的空間結構，使活性中心保持完整。在酶與底物結合後，整個酶分子的構象發生變化，這種扭動的張力使底物化學鍵容易斷裂。這種變化也要依靠非活性中心的協同作用。

一般單體酶只有一個活性中心，但有些多功能酶具有多個活性中心。大腸桿菌DNA聚合酶I是一條109 kd的肽鏈，既有聚合酶活性，又有外切酶活性。下圖是一種芽孢桿菌的DNA聚合酶I，聚合酶活性中心位於左側與DNA結合的結構域，外切酶活性中心位於右側結構域。

活性中心的基團反應性常與其他基團不同，所以一些試劑可以專一性地與活性中心中的某種殘基反應，而不與活性中心外的殘基作用。如DFP（二異丙基氟磷酸）只能與活性中心中的絲氨酸反應。而TPCK（N-對甲苯磺醯苯丙氨醯氯甲基酮）的專一性更強，只能與糜蛋白酶活性中心的His-57結合，稱為親和標記。

當沒有專一性試劑時，可用差示標記法：先用底物類似物保護活性中心，再加入修飾劑，與活性中心以外的基團反應，然後除去底物類似物，再加入同位素或熒游標記的試劑，此時試劑只能與活性中心的基團反應，所以被標記的就是活性中心。

紫外、熒光、園二色光譜等方法也可用與活性中心的研究。在酶與底物結合時，位於底物結合部位的生色團必然會發生某種變化，從而導致其光譜的變化。這些生色團可以是酶本身帶有的，也可以人工引入。這種方法可以用來判斷活性中心的構成，也可以研究催化的反應過程。

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