不可逆抑製劑可分為專一性與非專一性兩大類。專一性不可逆抑製劑只與活性部位的基團反應，與其它基團不反應，所以抑製劑與酶以固定的比例反應，即所謂有化學計量關係。同時，酶與抑製劑作用後會完全失活，抑製劑與失活的酶也不再發生反應。因為抑製劑需要進入活性中心才能起作用，所以當有大量底物存在時，底物先與酶的活性部位結合，抑制作用就會減弱，稱為底物保護作用。

專一性的不可逆抑製劑，又可以分為Ks型和Kcat型兩類。前者具有和底物類似的結構，通過與酶的親和力來對酶進行修飾，所以又稱為親和標記劑；後者被酶催化以後才具有抑制作用，稱為「自殺底物」。

Ks型不可逆抑製劑能與特定的酶結合，它們的結構中帶有一個活潑的化學基團，可以與酶分子中的必需基團起反應，使酶活力受到抑制。在這個過程中，抑製劑與酶的親和力決定了它的抑制作用強弱和選擇性高低。動力學上經常用酶與抑製劑複合物的解離常數Ks來表示親和力，所以稱為Ks型抑製劑。

親和標記劑只對底物結構與其相似的酶有抑制作用，具有專一性。例如，L-苯甲磺醯賴氨醯氯甲酮（TLCK）是胰蛋白酶的親和標記劑，而L-苯甲磺醯苯丙氨醯氯甲酮（TPCK）則是胰凝乳蛋白酶的親和標記劑。

自殺底物的結構中沒有直接的活性基團，只有潛在的活性基團，而且酶可以把它們作為底物來催化。當催化作用進行到一定階段以後，潛在的化學基團就會被活化，和活性中心發生共價結合，使酶失活。這種過程稱為酶的自殺失活作用，而這類底物則稱為「自殺底物」。因為它需要被酶催化才具有活性，所以酶的催化常數Kcat越高，抑制作用越強。因此，自殺底物也叫Kcat型不可逆抑製劑。

自殺底物所作用的酶，稱為自殺底物的靶酶。酶的自殺底物專一性非常高，平時以潛伏狀態存在，只有遇到靶酶時才會被激活，發揮抑制作用。所以針對某些病原菌或異常組織中所特有的酶，可以設計相應的自殺底物，作為副作用很小的高效藥物。

由於廣泛使用青黴素，很多菌株對青黴素產生了耐藥性，其原因多是細菌體內被誘導產生出一種能分解青黴素的β-內醯胺酶。近年來，合成了多種內醯胺酶的自殺底物，如青黴素亞碸衍生物等，可以恢復青黴素的殺菌效果，滅殺耐葯菌。

有趣的是，青黴素本身也是一種自殺底物。革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖構成，合成肽聚糖的最後一步需要轉肽酶（糖肽轉移酶）催化形成五肽橋交聯起來，才能具有功能。青黴素內醯胺環上的高反應性肽鍵會被轉肽酶活性中心的絲氨酸羥基親核攻擊，形成共價複合物，導致酶失去活性。這樣細胞壁就會有缺損，容易因滲透壓變化而破裂致死。

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