水解酶類（hydrolase）催化底物的水解反應，如蛋白酶、脂肪酶等。水解酶一般起降解作用，多位於胞外（如消化道中）或溶酶體中。有些蛋白酶也曾稱為激酶（如腸激酶，EC 3.4.21.9，現已改稱腸肽酶）。可分為水解酯鍵（如限制性內切酶）、糖苷鍵（如果膠酶、溶菌酶等）、肽鍵、碳氮鍵等13個亞類。

水解酶有不少位於胞外，容易獲得，而且一般結構簡單，不需要輔因子，適於工業應用。所以在酶工程中最早應用的酶多為水解酶，如澱粉酶、脂肪酶等。目前也是生產中應用最多的酶。

裂合酶類（lyase）催化從底物上移去一個小分子而留下雙鍵（或環）的反應或其逆反應，如醛縮酶、水化酶、脫羧酶等。當某個反應的合成方向更為重要，或者是唯一的合成方式時，可以使用英文名稱synthase，中文一般稱為「某某合酶」。根據斷裂鍵的類型，分為C-C鍵裂合酶、C-O鍵裂合酶等8個亞類。

IUBMB調整過分類，把一部分裂合酶轉移到移換酶分類中。比如檸檬酸合酶（citrate synthase）曾被列入裂合酶（EC 4.1.3.7），現已轉移到乙醯轉移酶中（EC 2.3.3.1）。

異構酶類（isomerase）催化同分異構體之間的相互轉化。包括消旋酶、差向酶、順反異構酶、變位酶（分子內基團轉移）以及分子內氧化-還原、分子內消去-加成反應等6個亞類。

連接酶類（ligase）催化由兩種物質合成一種物質，必須與ATP分解相偶聯。如DNA連接酶，氨醯-tRNA合成酶等。以前曾經將合成酶（synthetase）作為通用名稱，因為許多人將其與合酶（synthase）混淆，所以IUBMB於1983年將其改為連接酶。

根據新形成鍵的種類，共分為6個亞類，如C-O鍵、C-C鍵等。其中催化形成C-C鍵的只有羧化酶（carboxylase）一個亞-亞類（EC 6.4.1），如乙醯輔酶A羧化酶等。

需要注意的是，有人習慣把可以產生某種物質的酶直接就叫做某某合酶，而不管其具體反應機制。而且合酶與合成酶很容易混淆，所以叫做合酶或者合成酶的，其實什麼酶都有。也有不少酶在英文中synthase和synthetase的叫法都有，所以不能僅僅根據名稱判斷酶的分類。詳見《叫合酶（synthase）的，並不都是裂合酶》一文。

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