氮的轉運、信號轉導及利用效率（上）
氮的轉運、信號轉導及利用效率（上）
來自專欄從分子到細胞
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氮肥投入約佔肥料年施用總量的60％，是大多數非豆類作物種植中主要的生產投入。硝態氮是植物從土壤中獲得的兩種主要氮形態之一。在過去十年的研究中，關於植物如何從周圍環境中獲取硝態氮，以及如何將硝態氮有效地分配到不同的植物組織中以響應環境變化，如何感知和傳播硝態氮信號等方面取得了重大進展。本文從氮的吸收轉運 、氮信號的傳遞以及如何從分子水平提高氮利用效率這幾個方面展開。相關介紹分為上下兩部分，上篇介紹氮的吸收轉運，下篇介紹氮的信號傳遞和分子水平上提高氮利用率的策略。
硝酸鹽和銨鹽是植物可以利用的兩種主要的氮形式。在有氧條件下，根系吸收的硝態氮在細胞質中，經過硝酸還原酶轉化為亞硝酸鹽。亞硝酸鹽在質體或葉綠體中由亞硝酸還原酶轉化成銨鹽。對植物而言，過量的亞硝酸鹽和銨鹽是有毒的，植物需要協調土壤中氮的供應量、自身氮的需求量、根據土壤碳氮比，調控氮的吸收。植物吸收的硝態氮可以儲存在液泡，整合不同組織的氮供應和需求信息，調節氮代謝過程中酶的活性，並在轉錄水平、轉錄後水平調節代謝通路上各種組分的丰度，結合翻譯後修飾調控代謝通路中各組分的活性。
為了了解植物是如何整合不同來源的信息並作出適應性變化，研究人員鑒定出了一系列氮吸收、轉運、信號傳遞過程中的組分，整合這些組分並組成代謝、調控網路，便於大家深入瞭解氮的利用過程，為提高氮肥利用率提供新的策略。
第一部分，氮的吸收、運輸和分配
植物細胞、組織和器官對硝態氮的吸收、轉運和分配需要藉助轉運蛋白和離子通道完成，如轉運蛋白NRT1、NRT2，離子通道CLC、SLAC等。很多教科書上都說，硝態氮從木質部運輸，有機氮從韌皮部運輸。但是對於韌皮部硝態氮轉運蛋白的研究表明，韌皮部硝態氮的轉運對氮的分配也至關重要。
這裡詳細介紹NPF（NITRATE TRANSPORTER 1 (NRT1)/PEPTIDE TRANSPORTER (PTR) family）轉運蛋白的生理功能。
擬南芥和水稻中有大量的NPF基因，大部分NPF都是低親和的硝酸鹽轉運蛋白，但AtNPF6.3（NRT1.1/CHL1）和 OsNPF6.5（OsNRT1.1B）表現出對硝態氮的雙親和性。擬南芥有53個NPF基因，水稻有93個，大部分NPF蛋白定位在細胞膜。這些NPF轉運的底物不同，但是到底是什麼決定了這些NPF轉運蛋白的底物特異性仍然未知。
下表列舉了一些擬南芥和水稻中的NPF蛋白，它們的底物、新舊名稱、亞細胞定位、基因表達情況及功能。
1. 關於NRT1
1.1 硝態氮的吸收
植物從環境中以質子/硝酸鹽耦合的方式吸收硝態氮。
1.1.1 擬南芥NPF6.3（NRT1.1）是高等植物中第以個被克隆的硝態氮轉運蛋白，它一個雙親和性硝態氮轉運蛋白。在突變體中，無論外界氮供應水平是高還是低，吸收的硝態氮都會減少。NPF6.3會根據環境的N水平調節對硝態氮的親和性，NPF6.3的磷酸化決定這一過程。當環境中氮含量高，NPF6.3會形成二聚體，二聚體是較為剛性的結構，親和力低轉運速度慢；當環境中氮含量低，NPF6.3的Thr101發生磷酸化，二聚體解聚，成為比較柔性的結構，親和力高轉運速度快。
1.1.2 與NPF6.3不同，NPF4.6（NRT1.2）是一個組成型表達的單純低親和性轉運蛋白，該蛋白也可轉運ABA。
1.1.3 OsNPF6.5（OsNRT1.1B）與擬南芥NRT1.1同源，是雙親和的硝態氮轉運蛋白。作用於硝態氮的吸收和地上地下硝態氮的轉運。秈稻和粳稻中該基因一個單鹼基變異導致氨基酸置換，Thr327Met使得秈粳稻對硝態氮的吸收轉運存在差異，秈稻的氮肥利用率高於粳稻。
1.1.4 OsNPF2.4 是水稻的一個低親和硝態氮轉運蛋白，作用於硝態氮吸收和地上地下硝態氮的轉運，還影響氮的再利用，同時間接影響鉀的地上地下分配。
1.1.5 NPF8.9（OsNRT1）有兩個不同剪接形式的轉錄本，NPF8.9b有六次跨膜結構，蛙卵異源表達系統確定其有0.25mM硝酸鹽吸收活性，過表達NPF8.9a和NPF8.9b可以增加植株地上乾重。
1.2 硝酸鹽的地上地下運輸
硝態氮被植物細胞吸收以後，有的被同化利用，有的儲存在根部，有的會運往地上部。硝態氮的根莖運輸能力因植物種類而異，並受環境條件的制約。
1.2.1 AtNPF7.3（NRT1.5）介導硝態氮的木質部裝載。突變體中地上部硝態氮減少，地上/地下硝態氮比例降低，木質部汁液中的硝態氮含量也下降。
1.2.2 AtNPF7.2（NRT1.8）作用於硝態氮從木質部卸載及逆境耐受。該基因在韌皮部薄壁細胞表達，且其表達水平受到Cd鎘的誘導，突變體表現出氮依賴的鎘敏感表型。該基因通過增加根中氮的存留量提升逆境抵抗能力。AtNPF7.2和AtNPF7.3表現出Cd鎘脅迫下的拮抗功能，二者作用相反，也體現出植物既要適應逆境又要協調生長，需要功能上相關的不同基因進行調控和平衡。
1.2.3 AtNPF2.3 作用於鹽脅迫下的硝態氮轉運，減少逆境引發的根部氮積累。該基因組成型表達，但是其功能在鹽脅迫下比正常情況下更為重要。
1.2.4 AtNPF2.9 介導了硝態氮的韌皮部裝載，負調控硝態氮的地上地下運輸。突變體在高氮條件下，地上/地下硝態氮比值升高。
1.2.5 AtNPF5.11、AtNPF5.12和AtNPF5.16 定位在液泡膜，使儲存在液泡的硝酸鹽流出，以便將這些積累的硝態氮運輸到地上部。當外界缺氮，過表達這些基因使根中積累的氮減少。
1.2.6 OsNPF2.2 作用於硝態氮的地上地下運輸及液泡發育。在正常條件和缺氮條件下突變體表現出相反的氮分配表型，突變體中液泡的發育也受到影響。
1.3 硝酸鹽的地上地下運輸
運輸到枝條後，植物將根據葉子的發育階段、氮需求和硝酸鹽的容量決定硝態氮是被儲存還是被同化。協調不同組織之間的硝態氮分配是高等植物高效利用硝態氮的關鍵。
1.3.1 AtNPF6.2（NRT1.4） 介導了硝態氮在葉柄的儲存。該基因在葉柄和葉片中脈高表達，突變體中葉柄的硝態氮減少，葉片更寬大。該基因使硝態氮儲存在葉柄、葉脈，進而調控葉片硝態氮穩態，影響葉片發育。
1.3.2 AtNPF1.1（NRT1.12）和 AtNPF1.2（NRT1.11）將硝態氮分配到正在發育的組織。突變體中，完全展開的葉片氮積累量高，即使增加了土壤氮供應，突變體新生葉的硝酸鹽仍然較少。該基因將硝態氮轉入主脈韌皮部，使木質部流向韌皮部的氮被新葉再利用。
1.3.3 AtNPF2.13（NRT1.7）作用於缺氮條件下硝酸鹽向新葉的運輸。缺氮時，老葉的氮源流向新葉，在突變體中老葉表現出氮積累。缺氮時該基因的功能更為重要，相應的，降解AtNPF2.13 的E3泛素連接酶NLA 會在缺氮時受到miR827的抑制，使得AtNPF2.13可以在缺氮時將硝態氮轉入新葉。
1.4 種子發育和氮貯藏
對種子的發育而言，氨基酸和肽鏈這些有機氮是非常重要的。當然，硝態氮也會在種子積累，調控種子休眠、發育等生物學過程。
1.4.1 AtNPF2.12（NRT1.6）將硝態氮轉入發育中的胚。該基因表達於角果和珠柄區域的維管束，受粉後該基因的表達量升高。突變體中成熟種子的硝態氮含量減少，因為硝態氮對胚早期的發育十分重要，突變體中胚的敗育和種子發育缺陷會增加。
1.4.2 AtNPF5.5 影響擬南芥胚的氮積累，在胚中可以檢測到該基因的表達，突變體胚中氮含量下降。該基因的表達模式和亞細胞定位上不清楚。
1.5 氣孔運動調控
氣孔運動受到多個代謝/信號通路調控，以便乾旱時減少不必要的水分散失，維持二氧化碳的攝入。硝酸鹽可以作為滲透物質影響氣孔開閉。
AtNPF6.3（NRT1.1）表達於保衛細胞，施加硝態氮的條件下，突變體氣孔導度下降，蒸騰速率降低，對乾旱脅迫的耐受能力增強。
1.6 NPF轉運蛋白的其他功能
越來越多的證據表明，除了轉運硝態氮以外，NPF轉運蛋白還有很廣泛的其他類型的底物。
1.6.1 多肽
所有的NPF同源基因在非植物的有機體中均展現出二肽轉運活性。
擬南芥中AtNPF8.1（AtPTR1）、AtNPF8.2（AtPTR5） 和 AtNPF8.3（AtPTR2）在蛙卵和酵母異源表達體系中均展現出二肽而非硝態氮的轉運活性。AtNPF8.1 和AtNPF8.2 定位在質膜，作用於根和花粉的二肽吸收。AtNPF8.3 定位在液泡膜，調控種子發育和開花。
AtNPF5.2（AtPTR3）的表達受到逆境的誘導，也作用於抵抗細菌侵染。該基因可以回補酵母二肽攝入突變體的表型，但是二肽轉運和抵抗逆境及細菌病害之間的關係尚不清楚。
AtNPF8.4（AtPTR4）和AtNPF8.5（AtPTR6）定位在液泡膜，調控種子發育和開花，但它們沒有二肽轉運活性。
水稻的OsNPF7.3（OsPTR6）作用於短肽運輸，調節總氮含量，還能調控生長。
1.6.2 氟化物
AtNPF2.4 和 AtNPF2.5 有向外轉運氟化物的活性。AtNPF2.4 在根的中柱表達，作用於木質部裝載和氟化物向地上轉運。而 AtNPF2.5 在根的外皮表達，作用於向根外輸出氟化物。在高鹽的情況下，AtNPF2.4 的表達會下降， AtNPF2.5 的表達會升高，這兩個基因共同作用使高鹽條件下地上部氟化物減少。
1.6.3 鉀
AtNPF7.3 突變體中地下向地上的鉀運輸減少，但是酵母中並沒有發現該基因有鉀轉運活性。酵母表達該基因，展示出pH依賴的鉀外運活性。因此學者推測它可能作為一個質子/鉀的反向轉運蛋白，影響鉀的木質部裝載。
1.6.4 植物激素
有些NPF 在表達受體和共受體的酵母體系中顯示出 ABA / GA / JA-Ile 的轉運活性，還有一些NPF 既能轉運硝態氮，又能轉運植物激素。
1.6.4.1 生長素
AtNPF6.3（NRT1.1）轉運生長素的活性可以被硝酸鹽抑制。缺乏硝態氮時，它可以轉運生長素，在側根根尖的積累，進而抑制側根生長調整根繫結構。硝態氮抑制AtNPF6.3 對生長素的運輸，也可以是AtNPF6.3 的轉錄水平和蛋白水平下降。
1.6.4.2 ABA（脫落酸）
AtNPF4.6（NRT1.2/AIT1）、AtNPF4.5（AIT2）、AtNPF4.1（AIT3）和 AtNPF4.2（AIT4）在酵母體系中顯示出ABA的轉運活性。npf4.6 的擬南芥突變體植株表現出對ABA處理不敏感的發芽表型。
1.6.4.3 GA（赤黴素）
AtNPF3 不僅能影響硝酸鹽和亞硝酸鹽轉運，調控葉片硝態氮積累，還能夠影響根內皮的GA積累。蛙卵異源表達系統顯示，該基因的硝酸鹽轉運不影響GA轉運活性，但是AtNPF3 介導的GA刺激下胚軸伸長表型只在低硝態氮條件下才能表現。
1.6.5 硫代葡萄糖苷（芥酸）等次生代謝物
硫代葡萄糖苷（GLS）是富含氮、硫的次生代謝物，可以使十字花科植物免受食草動物啃食。5個NPF蛋白：NPF2.10（GTR1）、NPF2.11（GTR2）、 NPF2.9（NRT1.9）、NPF2.14 和 NPF2.13（NRT1.7）有芥酸的轉運活性。NPF2.10 和 NPF2.11 還具有低親和的硝態氮轉運活性，但是硝態氮不影響其轉運芥酸。蛙卵和酵母異源表達系統還顯示NPF2.10 有GA和JA-Ile轉運活性。
單萜類吲哚生物鹼（MIAs）是具有抗癌活性的生物鹼，如長春花鹼。長春花的CrNPF2.9 表達於表皮細胞，從液泡向外轉運輸出MIA中間體。
2. 關於NRT2
通常NRT2 是高親和的硝態氮轉運蛋白，蛙卵異源表達系統也顯示有些成員表現出對硝態氮的低親和性。擬南芥中有7個NRT2 基因和2個NAR2 基因，水稻中只有4個NRT2 基因和2個NAR2 基因。除了AtNRT2.8 外，7個NRT2 可以與NRT2.1 在細胞膜發生蛋白互作。當與NAR2 在蛙卵異源表達系統共轉時，AtNRT2.1、AtNRT2.2、AtNRT2.5、OsNRT2.1 和 OsNRT2.3a 的硝酸鹽轉運效率提升。但NAR2 對於AtNRT2.4 和 OsNRT2.3b 的底物轉運並不是必須的。
2.1 有4個NRT2作用於硝酸鹽吸收
AtNRT2.1 和 AtNRT2.2 是兩個相關的高親和硝酸鹽轉運蛋白。AtNRT2.4 和 AtNRT2.5 也是兩個硝酸鹽高親和轉運蛋白，但它們只有在缺氮時才表現出對硝態氮吸收的貢獻。
AtNRT2.1 在主根的成熟區表達，AtNRT2.4 在初生根幼嫩部分和側根遠端表達，AtNRT2.5 在初生根和測根根毛表達，AtNRT2.4 和AtNRT2.5 也在韌皮部和地上部葉片主脈和側脈表達。
2.2 AtNRT2.7調節種子硝態氮含量和休眠
AtNRT2.7 在種子中特異性表達，是唯一位於液泡膜中的NRT2轉運蛋白，負責將硝酸鹽載入到液泡中。突變體的種子硝酸鹽含量降低了35-70％. NRT2.7在原花青素積累或氧化過程中也發揮功能，雖然原花青素的表型與非硝酸鹽含量不相關，但是突變體的種皮是淡褐色。
2.3 AtNRT2.1、AtNRT2.5 和 AtNRT2.6 作用於植物與微生物的互作
NRT2.6 的功能缺失突變體沒有硝酸鹽相關的表型，但由於活性氧的產生減少，對致病性致病菌歐文氏菌（Erwinia amylovora）的攻擊更敏感，硝態氮不影響這一過程。NRT25 和 NRT2.6 的突變消除了根際細菌Phyllobacterium brassicacearum STM196 對植物生長的促進作用。NRT2.1 突變體顯示出對細菌病原體Pseudomonas syringae 的易感性降低，因為該突變體對細菌分泌的冠菌素不敏感。對於不同的NRT2轉運蛋白和不同的微生物，其對應的機制是不同的。
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