又到一年開學季，高校各大實驗室又湧進來一波波的小哥哥，小姐姐。對於初來乍到的小鮮肉來說，除了練好插槍頭的基本功外，其次就是跑好westernblot了。平時在實驗室中，經常會聽到一些小師弟小師妹在抱怨：「為什麼好看的westernblot條帶都是別人家的，而我的條帶跑得跟shi一樣」？今天小編就帶大家一起來探討跑好wb的幾條秘籍。

1. 選擇好的抗體

眾所周知，wb的基本原理就是利用抗體與抗原的特異性結合，來檢測特定蛋白的表達。所以，首先要選好的抗體。選抗體儘可能找一些靠譜的大品牌公司的抗體(abcam,CST,Sigma)。

下面我們介紹一個網站——Citeab來說明下抗體的選擇。

網址：citeab.com/

打開以後我們可以輸入要檢索的基因名字，比如foxo3a：

我們可以在左側選擇一抗/二抗、單抗/多抗、物種、應用技術、修飾、廠家等，比如我們選擇WB:

在文章右側就會出現對應的信息：在每個產品右側會有citations的數量，比如第二個:

我們可以直接單擊View PDF查看使用這個抗體發表的文章：

2. 製備合格的樣品

製備合格的的樣品，是成功的一半。裂解液的選擇也是關鍵（裂解液的選擇參考下表）。如果要提取做IP,coIP的蛋白樣品的話，則需要選取不含SDS的裂解液。在抽提蛋白時，要在裂解液中添加蛋白酶抑製劑，如果檢測的磷酸化蛋白，則要在裂解液中添加磷酸化酶抑製劑，並且要在冰上操作，避免蛋白降解。為了充分裂解樣品，也可以選用超聲處理細胞或組織樣品，超聲能充分破碎細胞膜和剪切DNA。但如果提取用於做IP的樣品，則不建議用超聲處理樣品。

3.膠要均勻，且濃度合適

選擇合適的膠濃度並膠要配均勻（PAGE膠濃度的分離範圍如下表）。膠如果配得不均勻的話，跑出來的條帶可能不齊或出現「微笑」「哭臉」狀條帶。要讓條帶跑得漂亮些的話，可以提前配好膠塊，用水打濕紙巾將膠板包起來放四度冰箱過夜，第二天再跑膠。

4.選擇合適的電泳電壓

電泳的電壓要合適，電壓過高容易導致電泳液和膠發熱。一般選擇60-80V跑濃縮膠，而選用100-120V跑分離膠。

5.選擇合適的膜

現在常用的膜有PVDF膜或NC膜。PVDF膜解析度高，背景低，具有溶劑耐受性，機械強度高，適合於SDS存在下與蛋白的結合。可用於常規染色，考馬斯亮藍染色，ECL和免疫檢測，使用前需用100%甲醇浸泡30秒。NC膜同樣具有高靈敏度和低背景的特點，但乾的NC膜較脆，無溶劑耐受性，使用前用緩衝液濕潤即可。常規染色，可用於放射性和非放射性檢測。孔徑0.45um的NC膜適用於一般蛋白，蛋白分子量小於20KD則選擇0.2um的NC膜。

6. 轉膜時間要恰當

轉膜時間的長短直接影響到轉膜效果。濕轉的話，要根據目標蛋白分子量的大小選擇合適的轉膜時間（參考下表）。若使用Bio-Rad Trans-BlotTurbo System半干轉的話，則選擇2.5A 轉7-15分鐘。如果單獨半干轉一塊膠的話，則選用1.5A 轉7-15分鐘。轉膜時注意趕走氣泡。

7.選擇合適的封閉液

化學發光法：用含5%脫脂牛奶的TBST；熒光法用5%脫脂牛奶的TBS;在搖床上室溫封閉1小時。

8. 選擇合適的抗體孵育濃度

抗體的孵育濃度直接關係到檢測結果。過高容易出現雜帶。相反，過低則有可能導致檢測到的條帶不清晰。抗體具體的稀釋濃度參照抗體說明書。一抗一般推薦四度搖床孵育過夜，二抗一般室溫孵育1-2小時。

9.洗膜

洗膜一般用TBST洗3次，每次5-10分鐘。

10.檢測條帶

第十：檢測。通常有2種方法來檢測條帶：一種是化學發光，化學發光法是最廣泛的檢測方法，若二抗上標記的過氧化物酶或辣根過氧化物酶，可以用ECL底物發生氧化還原反應。採用化學發光法檢測時，化學發光液A液和B液要現配現用，注意避光。另外一種是熒光法，通過採用合適的熒游標記抗體，結合oddessy儀器，實現多重wb分析。無須加發光液即可檢測到條帶。

以上這些就是做好wb的一些小tips,小夥伴們，你們get到了么？

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