關於CRISPR-Cas9文庫，你想要了解的都在這裡
近日，發表在Nature的《Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR–Cas9 screens》文章中，研究者利用CRISPR-Cas9文庫篩選技術構建了一個新的癌症依賴基因資源庫，並開發出一種可優先考慮現有癌症藥物靶點和發現新靶點的基因評分系統。
由Mathew J. Garnett和Kosuke Yusa領銜的Wellcome Sanger Institute團隊，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術這一「魔剪」，敲掉了橫跨30個癌種的324種癌細胞系中的18,009個基因，同時利用其開發的基因評分系統對600個最有希望的藥物開發靶點進行排序，找出了致癌關鍵基因。
近幾年，CRISPR已成為用於腫瘤藥物靶點發現的獨特工具，可用來突變、抑制或激活任何目標人類基因。利用其多方面的潛能，各種工具被開發出來，給科研工作者在生物體各個層面提供了極大便利。
其功能簡單列舉如下：
● DNA水平，可以實現精確基因編輯，大片段、單鹼基都能hold住；
● RNA水平，轉錄調控RNA上下調，RNA幹擾全都搞的定；
● 表觀遺傳水平，調控DNA鹼基甲基化不是夢！
● 分子定位， 基因檢測(SHERLOCK) 等等等等……
今天我們就嘗試由淺入深，跟大家聊聊CRISPR-Cas9基因編輯技術。
一、CRISPR/CAS9系統如何發揮作用？
第一步：引發雙鏈DNA斷裂（DSB）
簡單來說，CRISPR/CAS9系統是蛋白-RNA複合體(RNP)，兩者結合，一起發揮功能：
● sgRNA，通過與DNA鹼基互補配對將RNP定位於基因組；
● Cas9，核酸內切酶，切割DNA雙鏈誘發DSB（紅色箭頭）。
至此，CRISPR/CAS9系統的使命——瞄準了，切兩刀，結束。
第二步：利用細胞DSB修復機制——編輯基因組
CRISPR/CAS9造成一個DSB，而真正幫助我們實現目的的，其實是細胞本身的DNA修復機制：
● 無模板，非同源介導的基因編輯（NHEJ)，不精確，引發移碼突變，實現基因敲除（KO，Loss of Function)；
● 有模板，同源介導的基因修復（HDR），精確編輯。
一點點補充：
● 有很多CRISPR系統只需要瞄準了，即精確結合到DNA（或RNA）上；
● 不需要切兩刀，即通過點突變將CAS9的2個核酸內切酶相關功能域失活；
● 通過與CAS9融合表達另外一個功能蛋白（心有多大，舞臺就有多大）。
實現其他功能，簡單列舉如下：
二、CRISPR/CAS9介導的基因敲除
—強大的Loss of Function功能研究工具
說起Loss of function，必提RNA幹擾。那麼，比一比？
RNA幹擾殘留目的基因仍舊可能維持其功能（圖左）
CRISPR/CAS9可將基因完全消除進而揭示其功能（圖右）
三、如何用這一強大工具進行組學
層面的基因篩選呢？
先看流程：
如果CAS9和sgRNA通過兩個載體導入細胞，那麼需要就叫做「雙載體」系統，看左圖。
如果CAS9和sgRNA通過一個載體導入細胞，那麼需要就叫做「單載體」系統，看右圖 。
篩選原理：
主要原因是利用了慢病毒整合基因組的特性，以單載體文庫說明：
一定用慢病毒？慢病毒除了整合的特性，還有如下特點，讓你不得不愛：
做好CRISPR/CAS9文庫篩選實驗的關鍵是什麼呢？
結合流程，細胞感染、葯篩、收取細胞進行NGS都算是比較常規的操作，關鍵在：
CRISPR/CAS9文庫過關！
具體來說：
1. 針對靶基因設計sgRNA科學合理。
a. 特異性要高，脫靶率要低，活性還要高。
b. 盡量選擇多個轉錄本的共有外顯子。
2. 單個基因要有多sgRNA對應。
a. 雖然張峯庫靶點有效率平均高達80%（見下圖），但還是需要多靶點設計保證針對每個基因都有有效靶點。
b. 若基因敲除後有功能，多靶點可以互相印證，避免脫靶帶來的假陽性。
3. 文庫質粒構建和擴增必須經質檢達標。
像張鋒的human GECKO文庫，大概有12萬+條sgRNA，經過質粒構建、質粒擴增，必須經過NGS測序確保達到以下的高標準：
a. 左圖，高覆蓋率。質粒擴增後經NGS，測到的sgRNA覆蓋率要爭取向「24K」的標準看齊——99.99%。
b. 右圖，高均一度。不同sgRNA靶點含量差距不能太大。
4. 病毒包裝
在文庫篩選過程中，我們期望除了藥物，其他刺激的影響越小越好。所以病毒必須高滴度、高純度、無污染：
更重要的是，慢病毒文庫也必須有向24K看齊的高覆蓋率和高均一度。 下面是慢病毒感染細胞後抽取基因組NGS的慢病毒文庫質檢結果。
OK，經過兩輪NGS測序，我纔拿到了可以放心實驗的CRISPR慢病毒文庫。
原創：Genechem吉凱基因 如有侵權可聯繫刪除
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