Q1－轉錄組測序

問：轉錄組測序結果總不好，為什麼呢？

答：轉錄組測序的影響因素有很多，最基礎的：

  1. RNA的降解會嚴重影響測序的質量：若RNA的3端發生降解，則無法通過3端的poly A尾捕獲mRNA，反轉錄後進行測序也無法得到全部的cDNA；若RNA的5端發生降解，通過3端的poly A捕獲得到mRNA，測序結果將出現明顯的3和5偏好。
  2. RNA的起始量不足會影響測序的質量：RNA起始量不足時，需要增加PCR擴增循環數才能獲得足夠的量用於後續測序，這會產生大量的冗餘數據。

Q2－qPCR

問：想請問一下qPCR做標曲時的標準品是指的什麼？跑了溫度梯度後的產物進行系列稀釋還是逆轉錄後的cDNA？

答：標準品一般是用於絕對定量的qPCR實驗，標準品的構建是通過TA克隆的方法獲得目的基因的重組質粒，經過等比稀釋得到10（0次方）-10（7次方）的拷貝數梯度的DNA。

Q3－公共數據分析

問：geo下載了series matrix文件，是illumina晶元，矩陣value有負值有幾萬的值，上傳者說數據按照cubic spline 標準化，想找差異基因做熱圖的話，想問接下來怎麼處理呀？（差異基因已經通過geo2r找到並且根據p和logfc篩出了）

答：已經篩選好差異基因，接下來直接用篩選好的差異基因的標準化數據做Heatmap。

Q4－高通量測序

問：請問在用細胞樣本做二代測序後,發現比對到基因組上時, mapping率很低,可能的原因是哪些?

答：

  1. 可能是物種混淆。比如本來應該是人的細胞,不小心跟小鼠的細胞搞混,這個時候該樣本比對到人基因組上的mapping率肯定會低;
  2. 還有可能是在細胞培養過程中造成了雜菌污染。雜菌污染包括細菌、黴菌、病毒以及支原體污染，前幾種污染在細胞培養的過程中很容易被發現，比如培養基渾濁、細胞停止生長或者出現很多肉眼可見的黴菌等；但當支原體污染細胞後，培養液可不發生混濁，多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由於傳代、換液而緩解，因此易被忽視，所以發生支原體污染的可能性非常大。

當遇到這樣的情況，建議首先排查樣本物種混淆的情況，確認物種沒有混淆之後，最好對所有的細胞樣本進行一次支原體檢測。

Q5－多基因雷達

問：GCBI網站-多基因雷達中相關轉錄因子是如何得到的？原理是?

答：相關轉錄因子是依據基因在Pubmed，Transfac資料庫中收錄的有文獻依據的基因與轉錄因子的關係，從而構建相關轉錄因子的網路。

詳細可見鏈接：college.gcbi.com.cn/arc

Q6－生信分析

問：覆蓋率是什麼？覆蓋深度是什麼？測序深度和基因組覆蓋率的關係如何？

答：覆蓋率（breadth of coverage），指被測序到的鹼基佔全基因組大小或者目標區段大小的比例。由於基因組中的高GC、重複序列等複雜結構的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區域。

覆蓋深度（depth of coverage、覆蓋度），是指平均鹼基測序深度，即每個鹼基被測序的平均次數（測序得到的總鹼基數與待測基因組大小的比值）。

測序深度與基因組覆蓋度之間是一個正相關的關係，測序帶來的錯誤率或假陽性結果會隨著測序深度的提升而下降。

Q7－高通量測序

問：高通量測序中常常看到cDNA，請問到底是指什麼？

答：cDNA：complementary DNA，互補脫氧核糖核酸，與RNA鏈互補的單鏈DNA，以RNA為模板，在反轉錄酶的作用下所合成的DNA。


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