【從RNA提取到qPCR】qPCR實驗設計及案例分析
熒光定量PCR引物設計
qPCR引物設計需遵循一定的方法和原則,如研究的目的基因已經有文獻報導,可以使用文章材料和方法中給出的引物進行後續qPCR實驗;如沒有報導,須先確定目的基因的mRNA序列,有參物種可以直接到GenBank資料庫中查到準確的mRNA序列,無參物種須先通過高通量測序測出部分mRNA序列或進一步通過RACE實驗得到全長mRNA序列後再設計引物。
mRNA序列確定後就可以通過軟體來設計引物,推薦使用Primer3、Primer5、MFold等軟體進行設計,通過軟體可以幫助我們分析引物的基本質量,如引物序列中是否存在錯配,二聚體,發卡結構等,通過軟體設計的引物最終也要進行Blast比對,確保設計的引物在該物種中只能檢測目的基因,保證其特異性。
SYBR染料法引物設計需遵循以下原則:引物長度18~30 bp、產物長度100~400 bp、G/C含量40~60%、避免引物內含有互補序列 (尤其是3』端)、避免3』 端錯配、3』端不能出現連續三個以上的G或C、避免3』端出現T鹼基 、設計跨內含子引物。
TaqMan探針及引物需遵循以下原則:TaqMan探針退火溫度比引物高10℃、沒有連續相同的鹼基、探針位置儘可能靠近上游引物、C遠遠多於G、5』 端沒有G;TaqMan探針法引物設計原則除了包含SYBR染料法所有原則外,需注意5』 端不要有G,因為G會淬滅發光基團發出的熒光。
熒光定量PCR實驗設計
qPCR實驗設計要確定對照,對照設置包括兩個方面,其中一個方面為陰性對照,重要的陰性對照包括NTC(No template control)和NRC(No reverse transcriptase control),前者檢驗是否有模板污染,具體操作是以水為模板,觀察擴增情況;後者檢驗cDNA中是否有基因組DNA污染,具體操作是在反轉錄的時候多配製一個體系,不加反轉錄酶,其餘成分正常添加,經歷相同的反轉錄過程,以此為模板,觀察擴增情況。建議以cDNA為模板時,兩個陰性對照同時檢測下,排除模板及基因組DNA污染對定量的影響,如果以基因組DNA為模板,只需進行NTC檢測;
另外一個方面為陽性對照,包括:帶有PCR擴增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸、重組質粒DNA、體外反轉錄的RNA、來自於特定的生物體樣本的RNA或DNA及國際上公認的生物學標準物等。陽性對照可以幫助我們快速判斷失敗的擴增是否是試劑失效或儀器故障導致。
qPCR實驗設計要選擇合適的定量方法,研究基因表達差異最常用的是相對定量,它有兩個重要的方法:△△Ct法和雙標準曲線法。前者特點包括:只依靠Ct值、用於大通量(很多基因,如晶元結果)、計算簡單、估計性的結果、要求目的基因和內參基因擴增效率都比較好。後者其實是先做了絕對定量再進行比較,其特點包括:結果精確、對擴增效率要求不高、構建目的基因與內參基因的標準品、相當於兩個絕對定量、每次反應都要作標準曲線。
下面我們通過兩個具體的實驗案例來深入瞭解兩種定量方法的計算過程。
熒光定量PCR案例分析之△△Ct法
第一個實驗案例是運用△△Ct法進行表達量分析,作者比較病毒刺激細胞後,細胞抗病毒基因ISG54的表達情況差異。實驗樣品包括病毒刺激細胞以及對照細胞。使用的試劑包括RNA提取,反轉錄及SYBR染料法qPCR Mix。
因為是相對定量,涉及比較,因此要選擇內參基因進行校正,作者在此案例中選擇了GAPDH作為內參基因,設計內參和目的基因引物,完成兩個基因在實驗組和對照組模板中的qPCR檢測,統計各基因在兩個模板中的Ct值(參見圖一)。