結合樣本製備技術及數據非依賴性質譜技術高通量鑒定血清蛋白質

前言

數據非依賴採集（data independent acquisition，DIA）是近年來備受矚目的質譜採集技術之一，一度引領了定量蛋白質組學新發展。DIA是一種靶向蛋白質組學技術，其對選定質荷比（m/z）範圍內的所有離子進行碎裂和二級質譜分析。

DIA是數據依賴性採集（Data-dependent acquisition, DDA）的替代方案，DIA相比於DDA的最大的優勢在於高效測定複雜樣品中丰度極低的蛋白分子，極大地提高了定量分析的可信度有更高的定量準確性和可重複性。

圖：DIA與DDA對比基本信息

材料：血清

主要技術：DIA技術

期刊：J. Proteomics

影響因子：3.722

文章摘要

血清的高度複雜性和動態範圍使得基於質譜的血清蛋白質組極具挑戰，而血清生物標誌物研究迫切需要高通量、高準確性的血清蛋白質組學方法。

本研究建立了簡化的血清蛋白質組鑒定流程，可從1μL血清中快速準確地進行蛋白質組學分析。該工作流程結合了高靈敏度和可重複的樣品製備技術和DIA技術。與DDA相比，優化的DIA方法使檢測到的肽和蛋白質的數量翻倍，且具有更好的重現性，無需免疫富集和預分餾，單次DIA分析可在50分鐘梯度時間內定量300多種蛋白質。這些蛋白質丰度跨越五個數量級，且包含50多種FDA批准的疾病標記物。此工作流程每天可分析20份血清樣本，平均每個樣本可鑒定出約358種蛋白質。本研究用此流程對腎細胞癌（RCC）血清樣本進行分析並鑒定相關生物標誌物。

方法流程

數據較高的重複性

小鹿點評

這是一篇標準DIA分析流程的文章。通過多次DDA鑒定（多個餾分或多次重複）建立較為全面的參考庫，之後對血清樣本進行製備和DIA鑒定，結合參考庫對DIA數據進行分析。本文為建立快速高效的血清蛋白質組學方法，在樣本製備上沒有進行常規的血清去高丰度蛋白或分餾分，而是直接對血清樣本進行酶切及隨後的DIA鑒定，平均可鑒定到300多種蛋白質，數量上遠超過常規DDA模式，體現了DIA技術在蛋白質鑒定數及定量準確度上的優勢。

小鹿答疑

Q1. DIA技術和PRM技術可否共用資料庫？

回復：理論上如果是同一個樣本、共用同一個庫的話是可以的，但前提是實驗要在同一台質譜儀上進行，且時間間隔較短。

Q2. 如果樣品中有高丰度蛋白是否需要去除？

回復：碰到有高丰度蛋白的樣品，需要去除高丰度蛋白，費用也單獨收取。

Q3. DIA技術適用什麼樣的樣品？

回復：所有的樣品都可以做，只要蛋白的量滿足要求。

小鹿百科

DIA原理

液相色譜與串聯質譜（LC-MS/MS）相結合的技術成為蛋白質組研究的主要研究手段。在自下而上的蛋白質組學中，蛋白質通過蛋白水解酶消化成肽段，這些肽段通過高效液相分離後經電噴霧電離源（ESI）加上電荷，發射到質譜儀中進行一級質譜（MS）和二級質譜（MS/MS）的分析。一級質譜由肽段離子的質荷比和信號強度組成，二級質譜由肽段碎裂後的碎片離子質荷比和信號強度組成。

DDA為數據依賴性採集方式，選擇一級質譜中特定數量的肽段分子（如信號強度最強的前10個離子）進行高能碰撞碎裂，產生的碎片離子送入二級質譜檢測。

DIA為數據非依賴性採集方式，隨著時間連續設置一定範圍的質荷比窗口，對將通過窗口的全部肽段離子進行碎裂並用二級質譜檢測碎片離子的信號。相比之下，DIA模式不涉及到對肽段離子的限制性篩選，定量準確性和重複性都要優於DDA模式。但DIA模式產生的碎片離子譜圖過於複雜，丟失了肽段及碎片離子的對應關係，對其結果的解析較為困難。目前的方法是通過建立樣本的參考庫（如同一樣本的DDA數據），對DIA的混合數據進行去卷積分析來鑒定和定量肽段。

圖. DDA和DIA原理

DIA優勢及技術難點

DDA模式對肽段離子的選擇具有限制性和隨機性，存在較多的數據信息缺失，而DIA模式的目標則是獲得完整的數據，實現蛋白質的深度覆蓋和精準定量。此外在複雜樣品中，二級信號的定量比一級信號更為靈敏（例如一級質譜信號可能存在相似質荷比離子的干擾）。DDA模式為一級質譜信號定量，而DIA模式為二級質譜信號定量，因此DIA模式的定量準確性和重現性都更好。

DDA模式下肽段分子和其二級碎片離子有著對應關係，通過對已知資料庫的搜索匹配，即可得到樣本中的肽段及相關蛋白質信息。而DIA模式下肽段離子與其碎片離子之間的直接關係丟失（DIA光譜中的碎片離子可能是由多個肽段離子），複雜的譜圖仍然給後續的數據分析和統計學檢驗帶來很多挑戰。對此目前已有多個團隊開發出DIA分析的軟體，例如OpenSWATH和Skyline，這些軟體通過建立樣本的參考庫，對色譜峰進行抽提並分析。此外也有研發團隊提出不需要參考庫的數據分析方法DIA-Umpire，通過對肽段離子和碎片離子的匹配合成產生虛擬譜圖進而搜庫分析。因此，DIA技術非常適合一次性獲取數百上千種蛋白質更為全面信息（高覆蓋率，高準確度，高重複性）的研究。

上海鹿明生物科技有限公司，作為DIA服務提供者，是國內早期開展以蛋白組和代謝組為基礎的多層組學整合實驗與分析的團隊。經過不斷地完善發展，公司建立起了Labelfree、iTRAQ/TMT、DIA、PRM、L-WB、MPI、修飾蛋白組等蛋白組學技術平台和全譜代謝組、靶向代謝組、擬靶向代謝組、脂質組等代謝組學技術平台和相應的數據整合分析平台。迄今為止，鹿明完成服務項目上萬個，涉及醫學、農業、生態學及工業應用等多個研究領域，協助合作夥伴在Nature Genetics，Nature Communications，Mol Cell Proteomics等期刊發表SCI論文數百篇。

文獻來源

Lin L. et al., High throughput and accurate serum proteome profiling by integrated sample preparation technology and single-run data independent mass spectrometry. 2018, J Proteomics


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