PCR一直扩增的很好，但是突然就扩增不出来，有没有大佬可以帮我解答一下？
以烟草基因组DNA为模板，扩增一个基因片段，一直扩增的很好，但是突然就扩增不出来了，只有重新设计一对这个基因上别的位置的引物就可以扩增出来，但是过几天就又扩增不出来，有没有大佬可以告诉我一下问题出在哪啊？
1、同时用mix做一个其他基因的pcr，检测mix有没有问题，记得看看你的mix延伸速度，别是混用了其他人的mix，延伸太慢了肯定扩不出来。如果你的引物可以pcr其他东西有条带，也可以试试，看看引物有没有问题。
2、改变PCR退火温度，有杂带就提高温度，没条带就降低温度，或者用降落PCR程序，依次递减退火温度，试试能不能行。
3、如果mix没问题，改变温度没有影响，就推测引物或者模板有问题，看看是不是保存DNA的冰箱温度不够低，我实验室一般常用的DNA模板和引物保存温度是-20℃，不常用的放在-60℃或者-80℃。你可以设计新的引物，把原引物PCR不出来的模板包含进去，然后扩增出来转T载体上然后送测序，用T载体上的引物作为测序开始的两端，避免测序两端不准确的情况。然后比对序列是不是引物的地方突变了。
4、如果测序序列没问题，应该就是引物降解了，那就确实是你的引物没有保存好。
饭时一答。虽然我作为一个学术辣鸡...但是pcr失败我有pile of experiences。
你这个问题有细节问题描述的还不够详细，比如是做subclone还是genotyping，如果做subclone一般是不需要反复做同一对引物的PCR的，所以我对此有点困惑。另外也没有说明pcr做不出来的形态是什么样的。Lane是一片糊还是什么都没有，还是引物二聚体。。。等等。失败也是有各种样式的???，被实验摧残的我如是说。
Trouble shooting有几个方面可以寻找：试剂和仪器。
试剂方面有很多问题可循。引物，模板，酶或者mix都有可能。1.对于引物：因为是多次使用过的引物，所以不考虑引物不好而考虑多次冻融导致降解，解决问题就是重新订购新引物再进行尝试。2模板：浓度是否因为降解变低或者导致结合位点结合不上去，解决方法也是要重新制模板 另模板浓度测定一下是否还在酶所要求的浓度范围。3. 酶或mix：有一个薛定谔的定律就是：你永远不知道其他实验室成员在什么时候把什么试剂放在室温多久，所以 简单粗暴，重新换一只酶
对于仪器：如果结果不稳定 有可能是pcr仪不稳定或者不干净。解决方法：换别的lab的pcr仪尝试，或者将pcr仪的放置样品位置里里外外用酒精擦一遍再晾干 重p试试。
还有一些tips。。。然而我吃完饭了。。。同为实验狗，加油啦(? ??_??)?
PCR实验包括反应体系的配置和反应程序，反应体系中有模板、引物、dNTP、酶、buffer、Mg2+，反应程序又包括预变性、变性、退火、延伸和彻底延伸。那么在PCR出现问题时主要是从反应体系的各个组分和反应程序上来进行调节优化。
实验组无扩增条带
(1) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解（建议用新合成的引物进行尝试）；引物设计是否合理，可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物（如果之前用过该引物，可排除引物设计问题）。
(2) 模板
长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开，此时加入PCR Enhancer，可以有效降低解链温度；模板为粗品，有可能是DNA未释放出来（若样本为植物叶片，要确保植物为非多糖多酚植物，取新鲜幼嫩的叶片，并将叶片面积剪小，如黄枪头尖部面积大小；可适当延长裂解时间）或存在抑制物（建议降低模板浓度，尝试不同稀释倍数的模板）；若模板为cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度、完整度以及逆转录所用的引物（若扩增长片段，建议使用高质量的RNA逆转录，逆转录时不加随机引物）。
(3) 酶
反应所用的酶因保存或运输不当而失活，建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。
(4) 扩增体系
反应体系配制错误，建议重复实验。
(5) 反应程序
检查变性温度是否准确，PCR仪指示温度与实际温度是否相符，如果温度过高，酶在前几个循环就迅速失活，温度过低则模板变性不彻底；若模板为酵母菌，可将预变性时间延长10min；退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索最佳的退火温度；如果目的片段较长，可尝试Touch Down 程序；检查延伸时间是否充足。
(6) Mg2+浓度不合适
Mg2+浓度过低可影响PCR产量甚至使PCR扩增失败；Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性，应适当调整Mg2+浓度。
发布于 2020-12-03继续浏览内容功能强大的模板建站，简单拖拽即可生成网站
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经常遇到，这是玄学……
经常遇到，这是玄学……
原来这个问题是大家都会遇到的 ，之前我也遇到过，至今没有再出来。建议把所有东西换一遍，从头开始，某一个环节出问题都会导致没有条带，与其不断的排查，不如从头再来！
PCR最容易出问题的无非就是两个变数，引物和模版。
因为酶和buffer都是冻著的，配好的，只要你每次操作正确，正常储存，一般情况下都没啥事儿。
所以，你就做几个对照，大概就能找到问题的方向了。
引物，干粉和母液留底，方便之后比较。
模版，提纯好后，分装，验证是不是有降解和污染的情况。
上述的前提是你的其他实验条件包括PCR仪，水等因素保持不变。
寄己的问题寄己去解决吧！祝好。
这种P不出来的情况我也遇到过，排查了所有步骤，后来发现是PCR仪温控模块坏掉了
这种情况是很常见，只是导致这种情况的原因实在是太多了，仪器设备是否正常、实验材料是否正常、设定的条件是否需要调整等等，看你的描述，感觉问题可能出在引物或者模板上面，有可能保存不当受到污染降解了，可以试试去别的实验室，借用一下它们的仪器设备试一下。对了，戴好手套做。
分子生物学的问题排查起来很费时费力，最好换新的材料，用之前成功的条件再做一遍。有时很诡异什么都不变隔两天再做能P出来，就可能是之前实验的某个步骤细节出了小问题，这次避免了，但这种自己就很难自知自觉。
科研不易 ，加油了
检查模版是否放置室温太久讲解了（可以点样时候加一个原始模板）
用的酶会不会室温太久失效了（用一个阳性对照）
重新PCR程序检查程序
p了一个多月没见条带
然后换了个mix...好......好了
气死个人
我最近做点突，也遇到这样的问题。之前好好的蛮顺利的，然后突然就怎么都做不出来了。
太玄学了
请问楼主解决了么，我也遇到了这个问题，也是同样的条件突然扩不出来了，求指导
污染？样本质量差？
你说这种情况，建议查看引物保存有无问题，因为每次换完新引物就可以扩出来，也可能不是引物位置问题，而是由于保存不当引物失效。可以通过使用之前扩出来的产物稀释后作为模板，用扩增它的引物再次扩增看看是否能扩出来，这样最起码可以排除模板问题。
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