HPLC科普專題：色譜法的分離原理
第二章：色譜法的分離原理
在我的上一篇文章里，大概地講了一些色譜法的發展歷史。在今天的這篇文章里，我將詳細的展開闡述色譜法的分離原理。在我的學習生涯中，但凡涉及到原理的一些科目都相當地令人頭痛。原理性質的科目或者課程一般情況下都是在告訴你應然情景下的背後邏輯。
對了，還沒有闡述過為什麼突然開始寫HPLC這個冷門冷到爆，知道的人都不夠繞乒乓球一圈的應用技術。事情的起因大概是這樣的...在一個星期以前，老闆突然讓我做一個HPLC設備設施的使用情況調研。
於是，認真的我開始在網上到處分發問卷。在分發問卷的同時，我想，調研做都做了，乾脆寫幾篇文章普及一下這個有趣的小技術好了，也算複習一下當年學習過的知識。然後我就開始寫了...
我開始寫了哈！
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色譜法的分離原理本理：溶於流動相（mobile phase）中的各組分經過固定相時，由於與固定相（staionary phase）發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中的滯留時間不同，從而先後從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。
在這個原理中，有多個名詞是會產生閱讀障礙的。我們一個一個的解釋一下。
組分：組分是一個化學概念，是指混合物(包括溶液)中的各個成分
流動相：色譜過程中攜帶待測組分向前移動的物質稱為流動相
固定相：在色譜分離中固定不動、對樣品產生保留的一相。
（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）：關係
我有一種不祥的預感，看到這裡就快要失去你們了。
那麼我們簡單來說，流動相是攜帶樣品進入分析流程的物質。
固定相是用來分離被測組分的物質。
所以顧名思義，流動的一相即為流動相，固定不同的一相即為固定相。固定相的選擇對樣品的分離起著重要作用，有時甚至是決定性的作用！
液相色譜法在最初的發展階段是用直徑很大的玻璃管柱，在室溫和常壓下，用液位差（用液位差計測量）輸送流動相，稱為經典液相色譜法。
但是這種方法柱效低，分離分析時間長（常常需要幾個小時才能完成）。因此在經典液相色譜法的基礎上，高效液相色譜法（High performance Liquid Chormatography,HPLC）就迅速發展起來了。
HPLC與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小並且非常均勻。
小顆粒具有高柱效的優點，但同時會引起高阻力。此時為了完成分離動作，需要使用高壓幫助流動相的輸送。所以高效液相色譜法也可以叫作高壓液相色譜法（High Pressure Liquid Chormatography,HPLC）。還可以叫高速液相色譜法（High Speed Liquid Chormatography，HSLP），因為這種方法分析速度很快。
總之，提起HPLC，就代表四個字，多快好省
HPLC按分離機制的不同可以分為液-固吸附色譜法、液-液分配色譜法（正相與反向）、離子交換色譜法、離子對色譜法和分子排阻色譜法共5種分離方法。
我們按照先後順序對這5種方法簡單做一下闡述。
第一種，液-固色譜法
液-固色譜法就是使用固體吸附劑進行分離。被分離的組分在色譜柱上的分離原型是根據固定相對組分吸附力的大小不同進行分離。
這種分離過程是一個吸附-解吸附的平衡過程。
在液-固色譜法中，常用的吸附劑是硅膠 或者氧化鋁。粒度5-10μm。
這種分離方法適用於分離分子量200-1000的組分，大多時候用於分離非離子型化合物。用這種分離方法分離離子型化合物容易產生拖尾。
這種分離方法常用於分離同分異構體。
第二種，液-液色譜法
液-液色譜法的分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同，使得被分離組分分離。這個分離過程是一個分配平衡過程。
這種分離的操作方法是使用特定的液態物質塗在擔體表面，或者用化學鍵合於擔體表面，形成固定相。
塗布式固定（第一種操作方法）現在已很少採用。
現在行業內多採用的是化學鍵合固定相，比如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的機型不同可分為正相色譜法（NPC）和反相色譜法 （RPC）。其中正相色譜法常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。而反相色譜法 （RPC）在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用佔80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用範圍逐漸擴大，現在已經應用於某些無極樣品或易解離樣品的分析過程中。
第三種，離子交換色譜法
離子交換色譜常用緩衝液作為流動相。被分離組分在離子交換柱中的 保留時間 除了跟 組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子 強度 影響。
pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。事實上，流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不但不利於樣品的解離，甚至還會導致樣品以更快的速度流出，無法實現分離效果。
離子交換色譜法一般主要用於分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
第四種，離子對色譜法
離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液-液色譜法的分支。
它是當被測組分離子，在與離子對試劑的離子形成中性的離子化合物後，非極性固定相中溶解度增大 ，實現其分離效果改善。
這種方法主要用於分離離子強度大的酸鹼物質。
離子對色譜法常用的色譜柱為ODS柱（即C18）。流動相為甲醇-水或乙腈-水兩種組合溶液。
被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值，離子強度有關。
第五種，排阻色譜法
排阻色譜法利用分子篩對分子大小量不同，根據各組分排阻能力的差異，完成被分離組分分離。
這種分離方法的原理是小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；而大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。
排阻色譜法常用於分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質和、核酸等。
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