正被揭示的一個重要的生物學現象：RNA激活
科學家們認為RNA會使基因沉默，而不會增強基因表達。那麼，他們為什麼只是這樣認為呢？
 
位於達拉斯市（Dallas）的德克薩斯大學西南醫學中心的一名實驗室技術員羅莎琳·拉姆（Rosalyn Ram），在新的工作崗位上她從不尋常的第一次實驗得到數據後，她確信自己肯定把什麼東西搞錯了。據她回憶，實驗結果毫無疑問是很“怪異”的。她的實驗室負責人——戴維·科里（David Corey）和貝薩妮·雅諾維斯基（Bethany Janowski）夫婦已經證明：含有類似蛋白質骨架的合成DNA分子，即通常所說的肽核酸（peptide nucleic acid）能阻止基因轉錄。 2004年10月，他們嘗試著用小RNA分子來做同樣的事情，以檢測這一新的實驗室技術，他們滿心希望小RNA分子不能阻止基因轉錄。
但是，結果發現：像肽核酸一樣，小RNA分子能作用於相同的啟動子使得基因表達在轉錄水平上沉默。雅諾維斯基（Janowski）說：“當（拉姆）看到基因沉默時，她認為在實驗中出了差錯。她不想給我看實驗數據，因為她覺得那應該是一個陰性的結果。 ”
這些實驗數據確實不合常理：在轉錄起始位點處，單鏈肽核酸直接結合在解旋的DNA上，而雙鏈RNA一直被認為僅能把信使RNA（mRNA）作為靶標來阻止翻譯——這一過程已得到很好的闡述，即通常說的RNA干擾（RNA interference）或RNAi。那麼，它們是怎樣產生相同效應的呢？對於這一發現，雅諾維斯基（Janowski）說：“所有那些你認為能預測的事情，往往會出乎意料。”
科里（Corey）說：“我們用了幾個月的時間，才說服自己相信那個實驗結果是真實的。”但是，他們最終還是相信了。他們檢測了幾個不同的雙鏈RNA——每個雙鏈RNA含有21個核苷酸，如同用於RNAi實驗中的標準小干擾RNA（small interfering RNA）。所有這些RNA都與DNA啟動子區恰好互補，但與基因的mRNA幾乎沒有重疊，以保證這些RNA作用於轉錄而非翻譯。最後，在2005年9月，科里（Corey）和雅諾維斯基（Janowski）證明，導入的RNA能夠抑制多達90 %的基因轉錄。有趣的是，這一發現肯定了位於加州拉喬拉（La Jolla）的斯克里普斯研究所（the Scripps Research Institute）的凱文·莫里斯（Kevin Morris）的工作，他在一年前發表了人類細胞中該現象的第一個證據。
 
“RNA激活（RNA activati​​on）違背了我們所知的關於小RNA如何調控基因表達的所有成果。”——約翰·羅西（John Rossi）
 
    但是，在他們的實驗數據中，科里（Corey）和雅諾維斯基（Janowski）還注意到可能存在著比拉姆（Ram）在工作第一天的所見更令人難以置信的東西。他們的幾個似乎“失活”且不能減少基因表達的RNA使轉錄大約增強了25 %－50 %，這些相對較小的變化並不足以確定地說他們觀察到了基因激活。 “不過，這個實驗在我們頭腦中撒下了基因激活可能存在的種子。”科里（Corey）說。為了進一步研究這個趨勢，研究人員改用了其目的基因（the human progesterone receptor，即人類孕酮受體基因）有更低背景活性水平的一個細胞系，所得實驗結果非常明顯：不能抑制轉錄的相同的RNA，現在基因表達中能使表達量增加10到20倍。激活效應確實存在。
然而，在科里（Corey）夫婦發表這個發現之前，另一個實驗室已早一步發表了與他們的發現本質上相同的結果。加州大學舊金山分校的李龍承（Long-Cheng Li，中國湖北人）和羅伯特·佩雷斯（Robert Place）領導的一個團隊發現，以另外三個基因的DNA啟動子為靶標的小RNA也能開啟基因轉錄。像科里（Corey）和雅諾維斯基（Janowski）一樣，李和佩雷斯也曾一直期望是失活而非激活。李說：“我們覺得很奇怪，因為沒有觀察到由雙鏈RNA引起的基因沉默，相反，我們看到了強烈的基因激活。”
RNA激活公然違反了所有人對以RNA為基礎的調控的理解。人們一直認為只有通過RNA干擾途徑切碎mRNA，RNA才能使基因沉默，並不是在基因轉錄的點上，更不是通過基因激活。因此，RNA領域的許多知名人士根本不相信這一發現。
“要發表這項工作真是困難重重，”雅諾維斯基（Janowski）說，“因為RNA激活不合時宜，研究RNAi的學術界對其充滿敵視。”
這兩個RNA激活研究團隊在發表他們的論文時都遇到了麻煩。 2007年1月，科里（Corey）和雅諾維斯基（Janowski）的論文發表在《自然·化學生物學》（Nature Chemical Biology）上。此前，《科學》拒絕發表這篇論文。李和佩雷斯終於在2006年11月將其論文發表在《美國國家科學院院刊》（PANS）上，此前的兩年裡曾遭到4次拒稿。因此，當兩個月後，科里（Corey）和雅諾維斯基（Janowski）的論文發表了相同的基本研究結果時​​，李說：“這是一種解脫。”佩雷斯補充說： “知道其他人也看到了類似的現象，這種感覺好極了。”
然而，這兩個研究團隊都沒能給出RNA激活如何發生的合理機制。希望之城（City of Hope）——位於加州杜阿爾特市（Duarte）的綜合癌症中心（Comprehensive Cancer Center）的分子遺傳學家、該篇論文的評審人之一約翰·羅西（John Rossi）說：“我認為，李和佩雷斯的證據並不真正支持他們所報導的機制。RNA激活違背了我們所知的關於小RNA如何調控基因表達的所有成果。實驗數據是很清楚的，但是這一結果難道不是間接得到的嗎？我們想要更多的實驗來確認這個機制，但是李和佩雷斯並未做到。”
同樣，非論文評審人也不相信RNA激活的存在。地處紐約的洛克菲勒大學（Rockefeller University）的RNA專家托馬斯·圖許爾（Thomas Tuschl），在一封電子郵件中說：“我很難解釋他們的發現，並且什麼機制又能解釋RNA激活這一現象呢？”位於俄亥俄州克利夫蘭市（Cleveland）的凱斯西保留地大學（Case Western Reserve University）的RNAi研究者蒂莫西·尼爾森（Timothy Nilsen）補充說：“RNA激活似乎是太不同尋常、太特別​​了，它不像RNA干擾那樣是一個普遍的現象。對於RNA干擾，你已知道它是如何起作用的。”
這些擔憂合情合理。懷疑者認為，把核酸導入細胞是一個著名的有假象傾向實驗（artifact-prone experiment）。因此，觀察到的結果能很容易歸咎於導入的RNA與非靶標分子（nontarget molecule）的相互作用，例如一些意想不到的反過來能導致激活的蛋白質或RNA。
另一個問題是，在RNAi中，導入的RNA總是能與mRNA靶標完全配對，而RNA激活似乎並不遵循任何可以預測的規則。研究人員構建了與啟動子DNA片段配對的激活RNA（activati​​ng RNA），但是卻想不出一個可靠的設計方案。他們發現，RNA的目標序列（target sequence）中單個鹼基的不同，就能把激活劑變成抑製劑，並且反過來也一樣。更重要的是，對一些基因來說，最有效的激活RNA恰好在轉錄起始位點與DNA序列配對，但是對其​​它的基因來說，目標位點（target site）則位於轉錄起點上游。
研究RNAi的學術界採取了一種觀望的態度。圖許爾（Tuschl）說：“每當像這樣的有爭議的研究結果出現時，我將不會觸及此類問題，而是等待提出這個問題的實驗室後續的研究。”儘管RNA激活受到廣泛懷疑，研究人員仍在繼續探索RNA激活的發生機制，同時努力發表他們關於RNA激活的研究成果。 2006年9月發表在《自然·結構和分子生物學》（Nature Structural & Molecular Biology）上的論文中，科里（Corey）的團隊及由莫里斯（Morris）和羅西（Rossi）領導的一個團隊先後指出，由小RNA介導的轉錄沉默可能與來自Argonaute家族的蛋白質有關。兩個月後，李和佩雷斯也同樣證明，Argonaute蛋白參與了RNA激活。雖然對Argonaute家族中哪些蛋白質是最重要的存有一些異議，但研究者們仍然達成了某些共識。
“人們可能會挑剔RNA激活的機制，但這還為時尚早。RNA激活現象確實存在，這一點已十分清楚。”——約翰·麥惕克（John Mattick）
 
Argonaute蛋白是RNAi途徑的已知的成員，它有助於促進RNA與RNA之間的相互作用。因此，新發現的轉錄調控和Argonaute蛋白之間的聯繫表明，RNA激活的目標是天然存在的RNA，而不是DNA，這與肽核酸的情況相同（並且研究人員曾天真地認為，這也將適用於激活RNA）。後來，莫里斯（Morris）直接檢測了這個想法，並確認RNA之間確實在相互作用。
總之，雅諾維斯基（Janowski）說：“RNA激活建立了轉錄和轉錄後基因沉默之間的聯繫。”研究者們推理認為，RNA激活或許根本就不是一個令人難以置信的新現象。但是，仍存在這一問題：如果導入的RNA只與其它的RNA相互作用，那麼它們是怎樣影響轉錄的呢？
當科學家們探索RNA激活機制時，有一點逐漸變得明白，即人類基因組中的絕大多數基因都被轉錄成RNA，儘管這些RNA中只有很少一部分被翻譯成蛋白質。一些非編碼的RNA轉錄物（因為它們不能產生蛋白質，所以這樣稱呼），甚至位於編碼蛋白質的基因組區域中。而且，這種非編碼的轉錄很多都發生在染色體的兩條鏈上，它們與mRNA的轉錄方向相同或相反（相反也稱為“反義”，antisense）。科學家推測，這些普遍存在的非編碼RNA可能有某種目的，或許甚至在RNA激活中都起一定作用。
科里（Corey）的研究生雅各布·施瓦茲（Jacob Schwartz）使用反轉錄-PCR儀，對孕酮受體基因啟動子的周圍進行了掃描，以期找到非編碼RNA。他在轉錄方向上沒有發現任何編碼的RNA，但發現了3個跨越啟動子區的反義轉錄物。不過，施瓦茲（Schwartz）起初並不相信自己的實驗結果。研究生一年級時上的一門課《轉錄展望》（perspective of transcription）使他相信，在啟動子區將不會有任何RNA轉錄物。因此，他認為他看到的只是基因組DNA的污染物。在他說服自己之前的兩周里，他嘗試了各種方法去除PCR中的DNA雜質。最後，施瓦茲（Schwartz）證明，激活RNA和Argonaute蛋白結合在啟動子附近的反義轉錄物上，然後這個RNA-蛋白質複合體充當一個支架（scaffold），來“招募”和重新導向其它的蛋白質修飾因子（protein modifier），以加速或減慢轉錄。
科里（Corey）解釋說：“你必須認為這些啟動子是動態的。基因處於被開啟和被關閉的微妙狀態中。”在他看來，反義轉錄物是這一微妙平衡的調控物。因此，通過導入與這些反義轉錄物作用的RNA，他的團隊已能控制朝向激活或沉默的平衡。 “我可能是錯的，但這是與我們的實驗結果一致的最簡單的解釋。”科里（Corey）說。
特別是，科里（Corey）認為RNA激活現像多少與RNAi不同（儘管Argonaute蛋白參與了這兩個過程），因為他從沒有觀察到任何RNA轉錄物的切割。而且，他的實驗結果表明：轉錄激活和轉錄沉默最初都是通過與反義轉錄物相互作用的同樣方式進行的。
然而，莫里斯（Morris）對RNA激活的機制有另外一種解釋，他比科里（Corey）和雅諾維斯基（Janowski）早一年證明小RNA能抑制轉錄。莫里斯（Morris）重新分析了李和佩雷斯最初使用的激活RNA，並得出結論，激活RNA不以DNA啟動子為目標，這一結論加州大學舊金山分校（UCSF）的研究人員曾做出過假設（但從沒用實驗證明）。恰恰相反，這些激活RNA與跨越啟動子的長反義RNA轉錄物部分匹配，儘管莫里斯（Morris）發現目標序列實際上位於轉錄起始位點下游的幾百個鹼基對處，這比科裡（Corey）和雅諾維斯基（Janowski）定位的位點更靠下。
這些反義RNA通常能“招募”限制轉錄的蛋白質，但引入的RNA在Argonaute蛋白的幫助下能切碎反義轉錄物，從而釋放抑制因子（suppressive factor），在mRNA轉錄中總體增加。在莫里斯（Morris）的模型中，RNA激活現象與傳統的RNAi有相似之處，只是作用目標由mRNA轉錄物換成了反義RNA，莫里斯（Morris）說：“它是一種陰陽（ ying-yang）的東西”。
然而，莫里斯（Morris）相信，轉錄沉默是以不同方式進行的。關閉一個基因需要引入RNA（雙鏈的，或僅是單條反義鏈），使其作用於跨越啟動子區、能被轉錄但最終不被翻譯的mRNA轉錄物的稀有延伸區（rare extension）。改變這些mRNA的延伸區就能改變DNA的構型，阻止RNA聚合酶（RNA polymerase）進行正常的基因轉錄。
微小的遺傳密碼片段被稱為微小RNA（microRNA，縮寫為miRNA），它們有規律地圍繞細胞急速旋轉，對基因表達進行微調。位於馬薩諸塞州劍橋的懷特黑德研究所（the Whitehead Institute）的RNA生物學家戴維·巴特爾（David Bartel）說，人類基因組中已被識別的miRNA有400多個，每一個miRNA都能調控幾百個不同的基因。正如大多數的非編碼RNA一樣，這些小的細胞監督者們（cellular supervisor）長久以來僅被認為通過乾擾mRNA和減少蛋白質產生，來抑制基因的功能。但是，最近的研究表明，miRNA有多種功能。
去年，加州大學舊金山分校（UCSF）的羅伯特·佩雷斯（Robert Place）和李龍承通過掃描基因啟動子區域尋找天然miRNA的目標位點，對RNA激活進行了進一步研究。他們發現了一個與miRNA-373匹配的位點並證明，這個內源性RNA能以與合成RNA相同的方式顯著地上調轉錄（此文見於PNAS， 105：1608–13，2008）。佩雷斯（Place）說：“人們一直認為miRNA只能抑制基因活性。”這個研究“從原理上證明了miRNA能有相反的效應，它能導致基因激活”。
其他研究人員也發現了相同的效應。例如，威斯康星大學麥迪遜分校（the University of Wisconsin–Madison）的神經科學家洛古雷·威姆丹吉（Raghu Vemuganti）對老鼠大腦中的miRNA進行了研究，發現有幾個miRNA似乎能激活轉錄（此文見於J Cereb Blood Flow Metab，29：675–87， 2009）。他說：“從生物信息學方面，我已能自信地說大腦中正發生著轉錄激活；從實驗方面，我們仍需要證明它。”
但是，這些並非最先證明天然存在的RNA能刺激轉錄的例子。 2004年，加州拉喬拉（La Jolla）沙克研究所（the Salk Institute）的神經科學家弗雷德·蓋茲（Fred Gage），在老鼠神經乾細胞中發現了一個小雙鏈RNA，它能與蛋白質相互作用以激活對神經元功能很重要的基因（此文見於Cell，116：779–93，2004）。蓋茲說：“在細胞核中有許許多多的RNA。現在我們把它們當作垃圾或背景噪聲，但它們可能並不是。假設有這種過量的RNA，那為何細胞核還要為這個'危害'留下巨大的空間呢？”
更重要的是，內源miRNA也能在mRNA生成後的後轉錄水平上刺激基因表達。耶魯大學的分子生物學家瓊·施泰茨（Joan Steitz）和索哈·瓦蘇德旺（Shobha Vasudevan）發現，miRNA能依賴把細胞作為一個整體的活性來開啟和​​關閉蛋白質的合成：在增殖細胞或連續分裂細胞中，miRNA抑制蛋白質翻譯；在靜止期細胞中，miRNA能激活蛋白質翻譯（此文見於Science，318：1931–34，2007）。
在翻譯激活和抑制中含有相同的基本沉默成分（包括Argonaute蛋白和RNA結合蛋白），再次表明基因激活和基因沉默簡單地說可能就如同一枚硬幣的正反兩面。瓦蘇德旺（Vasudevan）說：“它們的結合可能不同，但在激活和抑制中，基本的Argonaute蛋白和基本的miRNA是一樣的。miRNA似乎還有許多其它功能，但其機制仍是未解之謎。”
佩雷斯（Place）說，莫里斯（Morris）對RNA激活的想法“似乎完全合理”，“但是他的模型並不能解釋我們全部的實驗結果”。李龍承和佩雷斯（Place）通過把他們感興趣的啟動子和綠色熒光蛋白基因結合在一起，創建了一個視覺跟踪系統（visually trackable system）。這一系統可使他們量化轉錄水平和精確定位RNA激活的目標位點。啟動子DNA突變後，觀察綠色熒光強度改變，研究表明，他們的激活RNA導向自身啟動子區中，這一點與科里（Corey）和雅諾維斯基（Janowski）的提議相似，而與莫里斯（Morris）所說的位於下游不同。不過，佩雷斯（Place）相信，他的激活RNA實際上靶向啟動子區中微小的、非編碼RNA轉錄物，這個轉錄物與mRNA的編碼方向相同，與反義RNA的相反。佩雷斯（Place）說：“我們的激活RNA沒有靶向反義轉錄物，而我們仍得到激活，這恰好與科里（Corey）和莫里斯（Morris）的模型相反。”
因此，李龍承和佩雷斯（Place）正致力於研究第3種尚未發表的對RNA激活的解釋。他們現正在做大部分工作。佩雷斯（Place）說：“為獲得適用於任何我們想要的啟動子的激活雙鏈RNA，我們已經設計了一套相當標準的規則。”截至目前，他的團隊通過使用對同一基因都起作用的幾個不同的RNA，已激活了大約15-20個基因，他補充說。
然而，重要的是，所有這3個轉錄激活模型都有一個共同的關鍵特徵，它們都對準了轉錄調控的同一個中心目標——非編碼RNA。去年12月發表在《科學》上的一篇論文表明，基因組中90 %以上的基因都被轉錄（向前轉錄，向後轉錄，向前、向後轉錄），並且活性基因的啟動子實際上並不“安靜”。那就意味著，有許多RNA在細胞中自由行動，它們可能有許多不同的秘密調控效應。
莫里斯（Morris）說：“如果認為RNA激活只有一條途徑，那就太目光短淺了。”所有的研究人員都同意這一點。佩雷斯（Place）說：“似乎有很多方式可誘導RNA激活。”同時，科里（Corey）說，即使還沒有一致的解釋，RNA激活這一現象仍的確存在。 “人們可以因為我們提出的問題多於給出的回答而批評我們的工作，但是從另一方面看這是一件好事。”
當前，所有的研究者都在積極探索轉錄激活在治療學和細胞學上的應用。在含有移植了人類前列腺癌細胞的老鼠模型中，李龍承和佩雷斯（Place）設計了能上調腫瘤抑制基因的RNA；莫里斯（Morris）不斷提高HIV的表達，希望能找到艾滋病病毒的藏身之處，以便能在臨床治療上殺死它；科里（Corey）和雅諾維斯基（Janowski）在用RNA進行細胞培養中激活了一個“重要的新陳代謝基因”（科里（Corey）拒絕對此詳細說明，因為這些結果還沒發表且具有商業潛力）。另外，佩雷斯（Place）和莫里斯（Morris）說，他們分別激活了幾個與多能性（pluripotency）有關的基因，如Oct4和Nanog，他們著眼於把成體細胞“重新編程”為類似胚胎的狀態。
莫里斯（Morris）現在正與斯克里普斯研究所（the Scripps Research Institute）的技術轉移辦公室（tech-transfer office）合作，以使他的研究商業化。科里（Corey）和佩雷斯（Place）的兩個團隊授權奧尼蘭姆製藥公司（Alnylam Pharmaceuticals）使用他們的技術，該公司總部位於馬薩諸塞州劍橋市，專門從事基於RNAi的治療研究。公司首席執行官約翰·馬拉加諾（John Maraganore）說：“對我們公司來說，從事RNA激活研究是一個非常合理的延伸。但是很明顯，RNA激活代表了一個全新的平台。雖然RNA激活還需要向結果可靠性和預測性的方向發展，但是已有很多我們能夠激活的目的基因。”
雖然關於RNA激活的幾個工作模型還在搖擺不定，但是RNA領域的一些研究人員現在已對RNA激活產生了興趣。澳大利亞昆士蘭大學（the University of Queensland）的RNA基因組學家約翰·麥惕克（John Mattick）說：“表面上看，現在正發生一個非常有趣的現象。人們可能會挑剔RNA激活的機制，但這還為時尚早。RNA激活現象確實存在，這一點已十分清楚。”
羅西（Rossi）說：“我認為RNA激活並不像人們所說的那樣有太多爭議。”他認為，RNA激活只是經典的、普通的RNAi的一個延伸（這和莫里斯（Morris）的觀點相同），當最初發現RNAi時也存有爭議。羅西（Rossi）說，RNA激活“正如後轉錄基因沉默一樣”，只是導入的RNA靶向非編碼RNA（對激活來說），而不是mRNA（對RNAi來說，導入的RNA靶向mRNA） 。位於伊利諾伊州埃文斯頓（Evanston）的西北大學（Northwestern University）的RNA研究者埃里克·宋提莫爾（Erik Sontheimer）同意羅西（Rossi）的說法，他說：“從小RNA實際上正在做的事情看，RNA激活並不是根本上的新現象，它仍屬於RNAi的範疇。”
現在，科里（Corey）也承認這個觀點。他說：“當我們剛開始研究RNA激活時，人們還不知道這些非編碼RNA轉錄物，現在他們知道了。它只是RNAi途徑的又一個分支，RNAi途徑可能有許多分支來行使許多功能。”
但是，並非每個人都相信RNA激活的存在。尼爾森（Nilsen）說：“RNA對哺乳動物轉錄的整體影響，受到整個RNA領域研究人員的一點懷疑。”另一位懷疑者圖許爾（Tuschl）說：“要想讓我相信RNA激活的存在，還需要更多徹底的生化實驗和更多被靶向的基因。”冷泉港實驗室（Cold Spring Harbor Laboratory）的功能基因組學負責人托馬斯·金杰羅斯（Thomas Gingeras）說，他無意中聽到其它幾個實驗室嘗試著重複RNA激活實驗，但是有成功也有失敗。他說：“如果莫里斯（Morris）和科里（Corey）報告的是一個真實的現象，那麼人們將能看到此現象並將致力於研究它。很顯然，在他們已完成的實驗模型中丟失了一些東西或存在著一些錯誤。人們將會等待，直到提出一個合理的機製或發現一些缺失的要素。”（其他幾位RNAi研究的領軍人物拒絕對這篇文章發表評論。）
    科里（Corey）說，他已經受夠了那些除非他能解釋清楚RNA激活機制的每一個細節才會相信他的發現的反對者們。他說：“我對那樣想的人沒有耐心了，我認為他們都是偽善的人。如果他們不能提供另外一種解釋，那麼他們就需要親自去做實驗。”莫里斯（Morris）的實驗室包括他自己在內總共只有3個人，他說，他熱烈歡迎其他競爭者，在生物學領域中有太多未知需要探索，RNAi和後轉錄調控“僅僅是這個開始”。他說：“涉及到（RNA介導的轉錄調控）的複雜性有許多個層次，整個RNA世界遠比我們所了解的複雜。”